張 策，陳淑良，劉向陽

癲疒間在經(jīng)過正規(guī)服用抗癲疒間藥物治療后，雖然能夠達(dá)到正常的血藥濃度，但其中仍有約30%的患者不能達(dá)到有效控制［1］，進(jìn)而進(jìn)展成為難治性對(duì)于這種難治性癲疒間的產(chǎn)生機(jī)制尚存在爭(zhēng)議，現(xiàn)基本考慮為多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，在對(duì)癲疒間患者腦部不同部位的切片進(jìn)行分析的過程中發(fā)現(xiàn)，癲疒間患者腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞缺失，星型膠質(zhì)細(xì)胞高度表達(dá)，膠質(zhì)纖維酸蛋白高度表達(dá)，神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)核、胞體、樹突等均有明顯的病理改變［2］。其中，P-糖蛋白等多種耐藥蛋白的高度表達(dá)是目前學(xué)術(shù)界比較公認(rèn)的產(chǎn)生癲疒間耐藥的一個(gè)機(jī)制［3-5］，作為這種耐藥性的深入研究，耐藥癲疒間模型的制作具有基礎(chǔ)性意義。本研究采用小鼠制作耐藥癲疒間模型，同時(shí)考察耐藥癲疒間小鼠腦內(nèi)P-糖蛋白的表達(dá)情況及腦組織的損傷情況，為耐藥模型逆轉(zhuǎn)的進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性昆明種小鼠(18～25 g)，由大連醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)期間小鼠生活在20～24℃環(huán)境下，環(huán)境濕度50% ～65%，自然晝夜節(jié)律。給予正常鼠糧和飲用水。

1.2 癲疒間模型的建立 取10只小鼠，每日給予低于痙攣劑量的致癇藥物戊四氮，40 mg/kg，每日12點(diǎn)腹腔注射，連續(xù)注射7 d。每次注射后觀察小鼠癲疒間情況0.5 h，記錄小鼠癲疒間發(fā)作級(jí)別和持續(xù)時(shí)間，小鼠癲疒間發(fā)作級(jí)別按racine分級(jí)定義如下［6］:0級(jí):無明顯反應(yīng);1級(jí):面部自主性運(yùn)動(dòng)(如舔吃，咀嚼);2級(jí):點(diǎn)頭、甩頭、眨眼、面部痙攣;3級(jí):2級(jí)+單側(cè)或交替性雙側(cè)前肢痙攣;4級(jí):2級(jí)+后退、雙側(cè)前肢痙攣;5級(jí):4級(jí)+動(dòng)物跌倒、尾巴上翹，耳朵縮卷。產(chǎn)生“5次連續(xù)的2級(jí)癲疒間或3次連續(xù)的4 級(jí)以上癲疒間”確認(rèn)癲疒間點(diǎn)燃成功［7］。

1.3 耐藥模型的建立［8］將癲疒間模型制作成功的小鼠給予低劑量苯妥英鈉40 mg/kg，1次/d灌胃給藥，連續(xù)給藥14 d，給藥后考察癲疒間小鼠的癲疒間發(fā)作情況，將給藥后仍有癲疒間發(fā)作并符合“產(chǎn)生5次連續(xù)的2級(jí)癲疒間或3次連續(xù)的4級(jí)以上癲疒間”的小鼠確定為耐藥癲疒間小鼠。另取20只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為2組，陰性對(duì)照組給予生理鹽水，耐藥癲疒間模型組制作耐藥癲疒間模型，最后取制作耐藥癲疒間模型成功的小鼠與陰性對(duì)照組一起進(jìn)行P-糖蛋白的表達(dá)及組織化學(xué)研究。

1.4 小鼠腦內(nèi)P-糖蛋白的測(cè)定 各組最后一次給藥0.5 h后處死小鼠，快速取全腦。按腦組織重量(1 mg∶1 mL)加裂解液，勻漿。置冷凍離心機(jī)，13 000 r/min、4℃離心10 min。加1 mL上樣緩沖液，10 μL 上樣，聚丙烯酰胺凝膠膜，30 mA，1.5 h。9 V恒壓轉(zhuǎn)膜40 min，1×麗春紅染液染25 min，4℃封閉過夜，將轉(zhuǎn)移膜置于用PBS稀釋200倍的一抗(鼠 C219 P-糖蛋白單克隆抗體Signet Labratories，USA)，37 ℃水浴過夜，用 TTBS室溫下脫色搖床洗10 min，共2次，再用TBS洗10 min。將轉(zhuǎn)移膜與以PBS稀釋12 000倍的二抗(C219第二抗體 Pakolytomatics，glostrup，Denmark)接觸，37℃水浴1.5 h。用 TTBS室溫洗10 min，共2次，再用TBS洗10 min，進(jìn)行DAB顯色反應(yīng)，避光放置5～10 min，出現(xiàn)條帶后終止反應(yīng)，將膜片進(jìn)行凝膠圖像分析。

1.5 免疫組化法考察小鼠大腦損傷情況 各組小鼠腦組織標(biāo)本采用10%甲醛固定，石蠟包埋后切片脫蠟至水，用0.01 M PBS洗5 min，共洗3次，置于3%H2O2室溫下 15 min，再用 0.01 M PBS洗5 min，共洗3次，用動(dòng)物羊血清室溫孵育15 min，傾去，勿洗。加Caspase-3兔抗鼠一抗(工作濃度1∶50)4℃過夜18 h，室溫下穩(wěn)定30 min后用0.01 M PBS洗3次，每次洗5 min。加入生物素化羊抗兔二抗37℃孵育20 min，0.01 M PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色2 min，用流水沖洗10 min，蘇木素復(fù)染 10 s，流水返藍(lán)10 min，脫水、透明封片，鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件，計(jì)量資料采用±s表示，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)考察兩組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥癲疒間模型的建立 戊四氮制作癲疒間模型7 d后，所有小鼠均由少癲疒間發(fā)作逐漸到5級(jí)發(fā)作，發(fā)作情況也趨于穩(wěn)定。造模成功后，小鼠均表現(xiàn)了對(duì)聲音敏感。在給予戊四氮第8天，給予低劑量苯妥英鈉1次/d灌胃給藥，連續(xù)應(yīng)用14 d，將符合“產(chǎn)生5次連續(xù)的2級(jí)癲疒間或3次連續(xù)4級(jí)以上癲疒間”確定為耐藥癲疒間模型，見圖1。在本次試驗(yàn)中，10只小鼠中有2只小鼠沒有耐藥，耐藥率為80%。

圖1 戊四氮誘導(dǎo)苯妥英鈉治療的耐藥癲疒間模型的建立(n=10)

2.2 P-糖蛋白在腦中的表達(dá) 小鼠造模成功后斷頭取腦，用Western blot方法考察腦內(nèi)P-糖蛋白的表達(dá)情況，見圖2。

圖2 兩組比較的Western blot蛋白條帶

從小鼠P-糖蛋白的全腦表達(dá)來看，耐藥癲疒間模型組較空白組小鼠腦內(nèi)P-糖蛋白的表達(dá)顯著增高(P＜0.01)，Gel-Pro analyzer灰度分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，P-糖蛋白表達(dá)的光密度值的平均值及95%可信區(qū)間用柱形圖表示。見圖3。

圖3 耐藥癲疒間模型組小鼠腦內(nèi)P-糖蛋白的表達(dá)情況

2.3 耐藥癲疒間對(duì)小鼠腦組織的損傷 小鼠造模成功后處死取腦，HE染色結(jié)果顯示無論是在海馬區(qū)還是皮層區(qū)，耐藥模型組與陰性對(duì)照組相比，小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元排列凌亂，核膜不完整，核仁染固縮，變形(P＜0.05)，見圖4。

圖4 小鼠腦海馬和皮層HE染色結(jié)果

免疫組化Caspase-3實(shí)驗(yàn)顯示無論是在皮層還是在海馬區(qū)，與陰性對(duì)照組相比，耐藥癲疒間模型組呈現(xiàn)Caspase-3的表達(dá)(P＜0.05)。見圖5。

圖5 小鼠腦組織Caspase-3免疫組化結(jié)果

3 討論

依據(jù)本文的方法能夠建立比較穩(wěn)定的耐藥癲疒間模型，通過對(duì)篩選出的耐藥癲疒間模型的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，耐藥癲疒間腦呈現(xiàn)P-糖蛋白的高度表達(dá)，支持P-糖蛋白高表達(dá)與癲疒間耐藥伴隨發(fā)生的觀點(diǎn)，如果發(fā)現(xiàn)一種藥物能夠顯著抑制這種P-糖蛋白的表達(dá)，將對(duì)臨床具有實(shí)際意義。耐藥癲疒間小鼠腦組織的免疫組化顯示，耐藥性癲疒間引起了小鼠大腦組織的損傷，造成大量的神經(jīng)元壞死，這種壞死可能形成一個(gè)新的神經(jīng)電傳導(dǎo)通路［9］，降低了癲疒間發(fā)作的閾值，使癲疒間患者的癲疒間更加不能控制。在免疫組化的研究中發(fā)現(xiàn)，采用Caspase-3的表達(dá)間接考察小鼠用藥后腦細(xì)胞神經(jīng)元的凋亡情況，得出耐藥癲疒間的發(fā)生伴隨著大量神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，可能參與了耐藥性的產(chǎn)生。

［1］馬愛梅，陳英輝，胡風(fēng)云.MK-801對(duì)耐苯妥英鈉和卡馬西平癲疒間大鼠模型腦表達(dá) P-糖蛋白的影響［J］.中華神經(jīng)科雜志，2010，43(6):444-446.

［2］Chengyun D，Guoming L，Elia M，et al.Expression of multidrug resistance type 1 gene(MDR1)P-glycoprotein in intractable epilepsy with different aetiologies:a double-labelling and electron microscopy study［J］.Neurol Sci，2006，27:245-251.

［3］Volk HA，Burkhardt K，Potschka H，et al.Neuronal expression of the drug efflux transporter P-glycoprotein in the rat hippocampus after limbic seizures［J］.Neuroscience，2004，123:751-759.

［4］Volk HA，Potschka H，Loscher W，et al.Increase expression of the multidrug transporter P-glycoprotein in limbic brain regions after amygdala-kindled seizures［J］.Epilepsy research，2004，58:67-79.

［5］Volk HA，Potschka H，Loscher W，et al.Immunohistochemical localization of P-glycoprotein in rat brain and detection of its increased expression by seizure are sensitive to fixation and staining variables［J］.Journal of Histochemistry and Cytochemistry，2005，34:517-531.

［6］吳俊芳.現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究方法［M］.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2006:726.

［7］Liu X，Yang Z，Yang J，et al.Increased P-glycoprotein expression and decreased phenobarbital distribution in the brain of pentyleneletrazole-kindled rats［J］.Neuropharmacology，2007，53(5):657-663.

［8］Jing X，Liu X，Wen T，et al.Combined effects of epileptic seizure and phenobarbital induced overexpression of P-glycoprotein in brain of chemically kindled rats［J］.British Journal of Pharmacology，2010，159:1511-1522.

［9］Pitkanen A.Drug-mediated neuroprotection and antiepileptogenesis:Animal data［J］.Neurology，2002，59(5):S27-S33.