李興起，汪秀志，陳晶，秦學功

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院）

大豆中的蛋白質(zhì)含量較高，營養(yǎng)成分豐富，且比較齊全、平衡，是人類主要的糧食作物之一，同時也是農(nóng)業(yè)飼料中很好的日糧蛋白源。但大豆中還存在多種抗營養(yǎng)因子，可以抑制人體及動物體內(nèi)某些消化酶的活性，并與營養(yǎng)物質(zhì)絡(luò)合成不易消化的成分，破壞動物體內(nèi)的某些器官，進而對動物的生理、生長、健康等造成不良的影響[1]，其中，大豆球蛋白（glycinin）是主要的抗營養(yǎng)因子之一，不容易降解，可刺激機體的血液系統(tǒng)發(fā)生免疫反應，同時也由于其抗原性可引起人體及動物的過敏反應導致腹泄，造成營養(yǎng)吸收障礙[2]。鈣離子是人體及動物功能執(zhí)行時必不可少的微量元素之一，小腸Ca2+離子通道分布、飲食pH值及腸壁各類酶活性，如Ca2+-ATP酶和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）都可對Ca2+吸收產(chǎn)生影響[3]。本實驗主要應用離體小腸回腸段培養(yǎng)法研究大豆中的主要營養(yǎng)抑制因子大豆球蛋白glycinin對Ca2+吸收的作用，并探討glycinin影響人體及動物微量元素吸收的相關(guān)酶活性機制。

1 實驗材料與設(shè)備

實驗中需要潔凈環(huán)境的無菌操作臺（哈爾濱東聯(lián)電子儀器公司）。大豆球蛋白（glycinin，Gly）和葡萄糖酸鈣 （Calium Gluconate，Glu-Ca2+） 以及Krebs-Ringer’s溶液（KR）均為市售產(chǎn)品。全自動生化分析儀為島津CL8000。實驗中所用的蛋白定量BCA試劑盒、Ca2+-ATPase和SOD活性測定試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。所用成年SD大鼠（清潔級）體重150 g～200 g，由北京維通利華實驗動物中心提供。

2 實驗方法

2.1 離體外翻小腸囊的制備及處理

該實驗參照文獻報道并做少量改動[4-5]。實驗大鼠于實驗前1周內(nèi)攝取低鈣飲食，自由飲水，并于處死前禁食12 h，快速分離小腸回腸中段，然后用生理鹽水快速沖洗腸管，每只鼠截取5cm左右腸段，置于室溫的標準Krebs-Ringer’s（KR溶液）溶液中，該溶液預先通入95%O2和5%CO2混合氣體。用玻璃棒將腸段輕輕翻轉(zhuǎn)，并于外翻小腸囊內(nèi)充以適量的Ca2+-free的Krebs-Ringer’s溶液，兩端用絲線結(jié)扎備用。然后在實驗前分別投放在含有10×Ca2+的Krebs-Ringer’s溶液，注意不可傷及小腸粘膜。灌流槽的Krebs-Ringer’s液溫度維持在37±0.5℃，并不斷充以95%O2和5%CO2混合氣體。

2.2 離子濃度測定

小腸囊制作完成后（n=24），隨機分為4組，即對照組（CK組）、glycinin組（Gly組，1mg·mL-1）、葡萄糖酸鈣組（Glu-Ca2+組，10mg·mL-1） 和聯(lián)合組[Combinae，Gly（1mg·mL-1）+Glu-Ca2+（10mg·mL-1）]，然后根據(jù)分組需要在灌流槽中分別加入相應試劑處理120 min。處理結(jié)束后，取各組腸囊內(nèi)液，采用全自動生化分析儀檢測Ca2+離子濃度。取腸囊中段稱重后剪碎冰凍研磨制成組織勻漿如下述方法測定Ca2+-ATP酶。

2.3 Ca2+-ATPase和SOD活性測定

小腸囊制作完成后（n=24），隨機分為4組，即對照組 （KR溶液組，）、glycinin組（0.4 mg·mL-1）、glycinin組（0.7 mg·mL-1）和glycinin組（1 mg·mL-1），然后根據(jù)分組需要在灌流槽中分別加入相應試劑處理120min。處理結(jié)束后，取各組腸囊內(nèi)液，采用全自動生化分析儀檢測Ca2+離子濃度。并取腸囊中段稱重后剪碎冰凍后研磨，按1∶9（W·V-1）比例加冰冷的RIPA組織裂解緩沖液，在冰浴中用組織勻漿器（5 000 r·min-1，15 s×2次）制成組織勻漿，然后經(jīng)4℃14 000 r·min-1×15 min離心，取上清備用并用BCA法進行蛋白定量。然后按試劑藥盒說明書（南京建成生物工程研究所），用定磷法同時測定Ca2+-ATPase，其活性單位表示為 μmol Pi·mg-1pro·h-1，采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測定SOD活力，SOD活性定義：每mg組織蛋白在1mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活性單位（U）。

2.4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用mean±sd表示，t檢驗作顯著差異性分析，P＜0.05為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 單獨的大豆球蛋白可劑量依賴性抑制Ca2+-ATP酶活性，但對Ca2+的吸收影響不明顯

實驗中，以大豆球蛋白劑量梯度處理各組小腸囊，并測定小腸囊內(nèi)液中Ca2+濃度和腸粘膜中Ca2+-ATP酶活性，結(jié)果表明單獨大豆球蛋白對小腸囊Ca2+吸收無明顯影響（圖1），但卻可劑量依賴性抑制Ca2+-ATP酶活性，各劑量處理組與對照相比均有統(tǒng)計學差異（圖2）。

圖1 單獨應用大豆球蛋白處理對小腸囊無機Ca2+吸收無明顯影響Fig.1 Single usage of glycinin to everted gut sacs did notaffect the absorption of inorganic Ca2+

圖2 單獨應用大豆球蛋白處理可劑量依賴性抑制小腸粘膜內(nèi)Ca2+-ATPase活性Fig.2 Single usage of glycinin to everted gut sacs inhibited Ca2+-ATPase activitieswith dose-dependentmanner

3.2 大豆球蛋白可抑制小腸對Ca2+的吸收

實驗中所觀察的4個處理組中，即對照組（KR溶液組）、大豆球蛋白組（Gly組，1 mg·mL-1）、葡萄糖酸鈣組（Glu-Ca2+組，10mg·mL-1）和聯(lián)合組[Combine，Gly（1mg·mL-1）+Glu-Ca2+（10mg·mL-1）]，大豆球蛋白明顯抑制小腸粘膜對Ca2+的吸收，Glu-Ca2+組與聯(lián)合組相比較有顯著性差異（**，P＜0.01）（圖3）。

圖3 大豆球蛋白明顯抑制小腸對有機Ca2+的吸收Fig.2 Glycinin significantly inhibited organic Ca2+absorption derived from calcium gluconate

3.3 大豆球蛋白引起的Ca2+吸收抑制與Ca2+-ATP酶活性抑制相關(guān)

實驗中所觀察的4個處理組中，大豆球蛋白對小腸粘膜Ca2+的吸收抑制與Ca2+-ATP酶活性抑制相關(guān)，與對照相比，Gly可明顯抑制Ca2+-ATP酶活性（***，P＜0.05），Glu-Ca2+組與聯(lián)合組相比較，有統(tǒng)計差異（+，P＜0.05）（圖4）。

圖4 大豆球蛋白可通過抑制Ca2+-ATPase活性抑制葡萄糖酸鈣的Ca2+吸收Fig.4 Glycinin inhibited absorption of Ca2+derived from calcium gluconate by inhibiting the activities of Ca2+-ATPase

3.4 大豆球蛋白glycinin可劑量依賴性增強SOD活性

實驗中，以glycinin劑量梯度處理各組（KR溶液組、Gly 0.4mg·mL-1、Gly 0.7mg·mL-1和Gly 1mg·mL-1），測量其SOD活性，結(jié)果表明大豆球蛋白glycinin可劑量依賴性誘導增強SOD活性，隨著glycinin濃度的增加，與對照組的差異逐漸明顯（圖5）。

圖5 大豆球蛋白劑量依賴性誘導增強小腸粘膜內(nèi)SOD活性Fig.5 Glycinin induced enhancementof superoxide dismutase（SOD）activitieswith dose-dependentmanner

4 討論

大豆是人類主要的糧食作物之一，因優(yōu)質(zhì)植物性蛋白含量高和營養(yǎng)成分平衡使其在人類的飲食及禽畜飼料中應用廣泛。但大豆中還存在多種抗營養(yǎng)因子，可刺激機體發(fā)生免疫反應和過敏反應等不良生理反應，進而危害人畜健康，使得針對抗營養(yǎng)因子的研究獲得大量關(guān)注[6-8]。其中，大豆球蛋白（glycinin）是主要的抗營養(yǎng)因子之一，不容易降解，也是大豆中主要的過敏源之一，有報道證明大豆球蛋白與仔豬的超敏反應有關(guān)，并能誘導淋巴細胞增殖和各類刺激因子如IL-4等的表達，進而引起嚴重的綜合癥[2，9]。

大豆球蛋白對Ca2+吸收是否有影響尚無相關(guān)報道。我們將大豆球蛋白逐漸增加處理濃度，在0.4～0.1mg·mL-1范圍內(nèi)顯示對Ca2+吸收無影響，但影響Ca2+吸收的因素有許多，如pH值、Ca2+存在狀態(tài)等，為此我們將葡萄糖酸鈣加入培養(yǎng)液中并加1 mg·mL-1的處理后再次檢測Ca2+濃度，實驗表明大豆球蛋白可以抑制Ca2+的吸收，該結(jié)果部分表明大豆球蛋白可影響Ca2+的吸收[10]。

Ca2+-ATPase活性與小腸對Ca2+的吸收相關(guān)[11]，我們已經(jīng)初步證明大豆球蛋白影響小腸對鈣離子的吸收，進而我們需要驗證該結(jié)果是否與小腸粘膜內(nèi)Ca2+-ATPase活性抑制有關(guān)。我們的實驗結(jié)果證明：在梯度劑量處理下，盡管大豆球蛋白不明顯影響小腸粘膜對Ca2+的吸收，但仍然能夠劑量依賴性的抑制小腸粘膜內(nèi)Ca2+-ATPase活性，并且1 mg·mL-1處理對葡萄糖酸鈣中鈣吸收相關(guān)Ca2+-ATPase活性檢測也證明了這一點。

同時，文獻報道顯示，各類有害因素（放射、內(nèi)毒素、缺血）引起的對腸損傷可抑制腸粘膜中SOD活性[12-13]，為此，我們也探討了大豆球蛋白是否也可抑制SOD活性引起氧化損傷加強對腸粘膜損傷，但我們的實驗觀察到，大豆球蛋白可劑量依賴性的誘導SOD活性增強，初步推測這一矛盾結(jié)果可能是大豆球蛋白反饋性誘導SOD活性增強以減少氧化損傷，其原因可能與大豆球蛋白處理時間有關(guān)，因多數(shù)研究是在體狀態(tài)下的實驗，處理時間也多為數(shù)周甚至數(shù)月，損傷明顯，而我們的實驗是離體小腸囊實驗，小腸本身存活時間就短，處理時間也短，因此結(jié)果不一致，同時，因目前尚無大豆球蛋白對SOD影響相印證，因此大豆球蛋白對SOD活性影響值得進一步探討。

綜上所述，實驗初步證明大豆球蛋白通過抑制Ca2+-ATPase活性阻礙Ca2+的吸收及轉(zhuǎn)運，并可能通過反饋性的增強SOD的活性以減少氧化自由基對粘膜的進一步損傷，為營養(yǎng)抑制因子的研究與應用提供了可靠的基礎(chǔ)理論支持，其中一些問題值得進一步深入研究。

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