曾春芳，萬譯文，李小玲，劉 麗

(農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心(長沙)，中國長沙 410153)

硝基呋喃類代謝物屬于一種人工合成的廣譜抗菌藥物，它主要包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮等.硝基呋喃類由于具有殺菌性而被廣泛應用于畜禽和水產(chǎn)等動物傳染病預防與治療［1-3］.該類藥物半衰期短，在動物體內(nèi)代謝速度快，與蛋白結合的代謝物產(chǎn)生穩(wěn)定的殘留，形成的代謝產(chǎn)物3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ)、3-氨基-5-嗎咻代甲基-2-噁唑烷酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基乙內(nèi)酰脲(AHD)均可使動物發(fā)生癌變和基因突變，人類長期使用可對其健康產(chǎn)生危害［4-6］.歐盟在1995年已全面禁止呋喃類抗菌藥物作為生長劑和殺菌劑用在飼料中，我國也于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類藥物的公告.由于硝基呋喃在動物體內(nèi)代謝速度快，不容易在動物組織中被檢測到，通過14C標記表明［7］，硝基呋喃代謝物在動物體內(nèi)以蛋白結合物的形式存在，在體內(nèi)能殘留數(shù)周，這些結合殘留物可通過在適當?shù)乃嵝詶l件下釋放出來，以達到檢測硝基呋喃殘留的目的［8］.

由于液相色譜串聯(lián)質譜方法靈敏度高，前處理方法簡單快速，可同時用于產(chǎn)品的檢測和確證，農(nóng)業(yè)部頒布了相關的標準采用液質法應用于食品當中硝基呋喃類代謝物的殘留檢測［9-10］.該方法操作簡單，成本較低，回收率滿足要求，但是由于水產(chǎn)品成分比較復雜，基質中含有大量的脂肪、蛋白質等雜質，前處理過程中沒有采取進一步的凈化，流動相溶解后會有乳化現(xiàn)象產(chǎn)生，容易產(chǎn)生基質效應，而且會對儀器造成污染影響結果的準確性，導致假陽性的情況出現(xiàn).本文建立了水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的液相色譜串聯(lián)質譜檢測方法，通過在前處理過程中采取固相萃取柱進行凈化，減少樣品帶來的基質效應，提高了色譜分析的功效，簡單快速，靈敏度高，而且節(jié)約成本，能夠實現(xiàn)藥物殘留的快速檢測，可以滿足水產(chǎn)品質檢以及相關基礎研究的要求.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ Quantum液相色譜-高分辨串聯(lián)四級桿質譜聯(lián)用儀(配用電噴霧離子ESI源);旋轉蒸發(fā)儀(瑞士布奇公司);高速冷凍離心機(日本日立公司);超聲波清洗器(昆山超聲波儀器廠);精密電子天平(梅特勒—托利多稱重設備系統(tǒng)有限公司);微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠).

AHD、SEM、AMOZ、AOZ 標準品(德國 R-Biopharm 公司);AHD-13C3、SEM-15N13C、AMOZ-D5、AOZ-D4(德國Witega公司);二甲基苯甲醛(色譜純，美國Fluka公司);二甲亞砜(色譜純，美國Fluka公司);甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia公司);正己烷(色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司);乙酸銨(色譜純，美國Fluka公司);甲酸(色譜純，美國Fluka公司);濃鹽酸(優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司);磷酸氫二鉀(分析純，天津光復科技發(fā)展有限公司);固相萃取HLB柱(3 mL，60 mg，美國Waters公司).

標準儲備液的配置:分別稱取硝基呋喃類標準品各10.0 mg，用甲醇溶解后轉移至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配置成100 mg/L的標準儲備液，在－18℃下避光保存.使用時將上述標準儲備液混合，用甲醇稀釋成 0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L 不同濃度的標準工作液.

內(nèi)標儲備液及使用液的配置:分別稱取10.0 mg各內(nèi)標標準品，用甲醇溶解并定容，配成100 mg/L的標準儲備液，在－18℃下避光保存.準確吸取各內(nèi)標儲備液，用甲醇逐級稀釋配成0.01 mg/L的混合內(nèi)標使用液，在－18℃下避光保存.

1.2 色譜質譜條件

色譜柱:Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(2.1 mm ×100 mm，5 μm);柱溫:30℃，流動相 A 為甲醇;B為2 mmol/L的乙酸銨溶液(含0.1%的甲酸);進樣體積:10 μL;流速:0.25 mL/min，流動相梯度見下表1.

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Elution process of the separation

采用電噴霧離子源(ESI);噴霧電壓:4.1 kV;離子傳輸毛細管溫度:350℃;碰撞氣氬氣壓力:0.1 Pa;鞘氣流量:40 arb;輔助氣流量:30 arb;掃描模式:多反應監(jiān)測(SRM);硝基呋喃類代謝物的母離子、子離子和碰撞能量見表2.

表2 8種藥物的SRM采集參數(shù)和標準曲線Tab.2 SRM parameters and linear equations for 8 drugs

1.3 樣品前處理

稱取2 g樣品至于50 mL離心管中(精確至0.01 g)，加入200 μL 0.01 mg/L的混合內(nèi)標溶液，再加入5 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液和0.2 mL 0.5 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，在漩渦混合儀上充分混合1 min.置于恒溫水浴振蕩器中(37℃)避光振蕩16 h，取出離心管冷至室溫，加入5 mL 1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，加入8 mL正己烷漩渦混勻后放入離心機離心10 min(6 000 r/min)，分層后取下層水相待過柱，固相萃取柱(HLB，3 mL，60 mg)依次用3 mL甲醇，6 mL水活化，取備用液過柱，采用在大氣壓力下自然過柱.過完樣品后，加入3 mL水淋洗并抽干.用4 mL乙酸乙酯分2次洗脫，洗脫液于40℃氮氣吹干后，加入1.0 mL流動相溶解殘渣，再加入2.0 mL正己烷放入離心機離心5 min(5 000 r/min)，取下層液體過0.22 μm濾膜，濾液供液相色譜-質聯(lián)用儀測定.

2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇及優(yōu)化

考察了甲醇與2 mmol/L的乙酸銨溶液不同體積比例(5∶95、10∶90、15∶85、20∶80)的混合液作為流動相時對目標物分析的影響，綜合考慮目標物的響應值和出峰的時間、峰形的尖銳性，本文選擇2 mmol/L的乙酸銨溶液:甲醇(V∶V=80∶20)為本實驗的最佳流動相.由于水產(chǎn)品成分比較復雜，基質中含有大量的脂肪、蛋白質、碳水化合物以及色素等雜質.本文比較了在調(diào)節(jié)pH后加入8 mL正己烷離心和加入流動相后再加入2 mL正己烷離心2種不同的凈化方式，這2種方式去脂的效果均不錯，溶液也較澄清，但是第二種凈化方式，回收率較低，在60%以下，第一種凈化方式的回收率滿足試驗要求.

2.2 固相萃取實驗

固相萃取是一種色譜分離的前處理方法，主要依靠固相萃取柱來進行凈化，不同的基質選擇不同材料的固相萃取柱，填料的類型決定了吸附能力的大小以及回收率的高低，本文比較了4種不同的固相萃取柱(C18500 mg/3 mL，HLB 60 mg/3 mL，MCX 150 mg/6 mL，Alumina-N 60 mg/3 mL)對硝基呋喃類代謝物的凈化效果，其回收率的結果見圖1，本實驗選用HLB柱作為硝基呋喃類代謝物的固相萃取柱，回收率均滿足要求.

固相萃取過程中的洗脫液一般選擇甲醇、乙腈或者乙酸乙酯，本實驗采用乙酸乙酯作為洗脫液，得到良好的洗脫效果.洗脫方式主要考察了一次4 mL、4 mL分2次以及9 mL分3次的3種洗脫方式，從實驗結果(表3)來看，當用4 mL乙酸乙酯溶液進行洗脫時，目標物洗脫不完全，還有部分目標物在組合SPE柱上沒有被洗脫下來;當用分2次洗脫時(2×2.0 mL)，目標物被完全洗脫，回收率良好;當用洗脫液分3次洗脫時(3×3.0 mL)，回收率與2次洗脫淋洗時差不多，因此本實驗選擇操作簡單、節(jié)約試劑的2×2.0 mL分2次洗脫的方式.

圖1 不同固相萃取柱的硝基呋喃類代謝物回收率Fig.1 Recoveries of metabolites of nitrofuran on different SPE columns.

表3 洗脫方式對回收率的影響Tab.3 Influence of elute style on recovery

2.3 色譜條件的選擇及優(yōu)化

流動相的pH值會影響目標物在色譜柱中的分離.本實驗考慮采用揮發(fā)性電解質乙酸銨來做為流動相，同時加入0.1%甲酸控制流動相pH值，采用合適的梯度洗脫程序，不但很好地實現(xiàn)了各種目標物的分離，并且得到了比較理想的色譜峰，峰形尖銳且對稱性好，增大了分子離子峰的峰強度.在8 min內(nèi)，各種硝基呋喃類代謝物均得到了較好的分離.色譜圖見圖2.

2.4 質譜條件的選擇及優(yōu)化

根據(jù)硝基呋喃類代謝物的結構特征，采用ESI正離子電離模式，以流動注射泵連續(xù)進樣對1.0 mg/L的標液進行Q1全掃描，掃描范圍為200～400 m/z之間，得到每種組份的分子離子，分別向其分子離子施以碰撞能量形成子離子，接著進行子離子全掃描，找出豐度最強的碎片離子為定量離子，豐度次強的碎片離子為定性離子.同時優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量、鞘氣與輔助氣流量等質譜條件，使母離子和子離子組成的特征離子的豐度和比例達到最佳.得到1.2中最佳質譜條件.

2.5 線性范圍和靈敏度

配置0.5、1.0、5.0、20.0、50.0 μg/L 的系列標準工作溶液，采用內(nèi)標法定量，以待測物的質量濃度 X(μg/L)為橫坐標，待測物與內(nèi)標物的峰面積比值Y為縱坐標制作標準曲線，得到硝基呋喃類代謝物的回歸方程和相關系數(shù)(見表2).由表2可知，硝基呋喃類代謝物在0.5～50.0 μg/L在范圍內(nèi)其標準曲線的線性關系良好，相關性系數(shù)R2在0.997以上.在方法規(guī)定的取樣質量條件下，在陰性樣品中添加2種混合標準溶液(添加水平為0.25 μg/kg)經(jīng)測定信噪比(S/N)均大于3，表明這4種物質的檢測下限(LOD)為0.25 μg/kg，在陰性樣品中添加2種混合標準溶液(添加水平為0.5 μg/kg)經(jīng)測定信噪比(S/N)均大于10，表明其定量下限(LOQ)可為 0.5 μg/kg.

2.6 回收率與精密度

向草魚、中華鱉和對蝦陰性樣品中分別添加5、20、100 ng/g 3個水平的添加實驗，每個添加水平進行3次實驗，每次平行測定6次，按1.2節(jié)所述條件進行加標回收率實驗，所得結果為回收率為68.6% ～106.2%，相對標準偏差為1.2% ～10.3%，符合國內(nèi)外有關標準和法規(guī)的要求，結果見表4.

圖2 魚肉中硝基呋喃類代謝物(25.0μg/L)及其內(nèi)標溶液的提取離子流色譜圖Fig.2 Extraction ion chromatograms of metabolites of nitrofuran(25.0μg/L)in fish and their internal solution

表4 4種藥物在空白樣品中的添加回收率和相對標準偏差(n=6)Tab.4 Recoveries and relative standard deviations of four drugs in blank samples

3 小結

通過對前處理條件、色譜條件以及質譜條件的優(yōu)化，建立了水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留的檢測方法.結果表明，該方法在0.5 ～50.0 μg/L 范圍內(nèi)，硝基呋喃類代謝物檢測下限(LOD)為0.25 μg/kg，其定量下限(LOQ)可為0.5 μg/kg;在3個不同的添加水平下，其回收率為68.6% ～106.2%，相對標準偏差為1.2% ～10.3%.本方法前處理步驟簡單、回收率穩(wěn)定、精密度好，滿足我國以及歐盟等國家的限量要求，可以作為水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的檢測方法，并可為該類藥物在水產(chǎn)品中的消除規(guī)律及毒理評價提供靈敏、準確的分析手段，對水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的溯源和衛(wèi)生監(jiān)督提供了技術支撐.

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［10］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法［S］.北京:中國標準出版社，2006.