許亞娜， 許 倩， 劉 鐳

(1.河北省承德市婦幼保健院， 河北 承德 067000 2.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 河北 承德 067000 3.承德醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室， 河北 承德 067000)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，治療失敗的主要原因是具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞在術(shù)前或術(shù)中脫離原發(fā)灶隨血行轉(zhuǎn)移。還有學(xué)者提出微轉(zhuǎn)移是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，其價(jià)值優(yōu)于腫瘤的分級(jí)和分期。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤的血行微轉(zhuǎn)移，對(duì)減少日后轉(zhuǎn)移性腫瘤的發(fā)生、改善預(yù)后、提高生存率，具有重要的意義。FAM83A是一種新鑒定的腫瘤特異性抗原［1］，研究發(fā)現(xiàn)其在肺癌患者外周血中高表達(dá)，對(duì)肺癌的預(yù)后和治療評(píng)價(jià)具有指導(dǎo)意義［2］。本文通過(guò)腫瘤基因組解剖計(jì)劃(CGAP)SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)FAM83A基因在乳腺癌外周血中也高表達(dá)。以該基因作為分子標(biāo)記物，測(cè)定了乳腺癌患者外周血的微轉(zhuǎn)移情況，并進(jìn)一步分析該基因與乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料:收集2009年11月至2012年8月在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科病歷資料完整的乳腺癌外周血標(biāo)本84例，均為女性，年齡21－82歲，中位年齡52歲。

抽血前均未接受化學(xué)治療和放射治療。所有患者均經(jīng)手術(shù)治療證實(shí)，手術(shù)后均經(jīng)病理確診。其中59例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，4例單純癌，3例濕疹樣癌，11例髓樣癌，7例浸潤(rùn)性小葉癌。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性53例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性31例。Ⅰ和Ⅱ期乳腺癌患者56例，Ⅲ和Ⅳ期乳腺癌患者28例。雌激素受體(ER)陽(yáng)性51例，陰性33例。孕激素受體(PR)陽(yáng)性39例，陰性45例。HER2陽(yáng)性43例，陰性41例。正常捐獻(xiàn)者外周血60例，均為女性，年齡22－76歲，中位年齡為49歲，與乳腺癌組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)胸片和B超檢查未發(fā)現(xiàn)乳腺相關(guān)和其它疾病。

1.2 差異基因的篩選:利用CGAP提供的SAGE Genie數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cgap.nci.nih.gov/SAGE)，選取數(shù)字基因表達(dá)演示(DGED)工具。選擇乳腺癌組織和正常白細(xì)胞兩個(gè)池，設(shè)置F值為16，即表達(dá)差異大于16倍以上，P值設(shè)置為0.01。差異表達(dá)的基因按差異顯著性高低排序，比對(duì)出在短序列標(biāo)簽文庫(kù)和長(zhǎng)序列標(biāo)簽文庫(kù)中都出現(xiàn)的差異基因，作為候選基因。

1.3 總RNA提取和cDNA合成:將3－5mL外周血置于淋巴細(xì)胞分離液上，密度梯度離心法分離單個(gè)核淋巴細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按106個(gè)細(xì)胞/mL在1.5 mL eppendorf管中加入適量TRIzol試劑，提取總RNA。分光光度法測(cè)定純度后取5μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN)操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.4 實(shí)時(shí)半定量巢式PCR方法檢測(cè)外周血癌細(xì)胞:第一輪PCR反應(yīng)體系包括:2.5μL外周血的cDNA模板，0.2μmol/L 外側(cè)引物(上游序列為:5’CACTTCTTGGAGGTGCCCTGCACG 3’;下游序列為:5’TAGAGGCAGCCAACAAGCGTG 3’)，0.2 mM dNTP，50 mM Tris－HCl(pH 8.3)，10 mM KCl，5mM(NH4)2SO4，2 mM MgCl2，0.75 U of Taq polymerase ，總體積為25μL。反應(yīng)條件為:94℃變性 20s，62℃30s，72℃延伸 80s，35個(gè)循環(huán)后，再72℃延伸10min。

取2μL第一輪PCR的產(chǎn)物作為第二輪的模板，20μL PCR反應(yīng)體系還包括:0.25μmoL/L內(nèi)側(cè)引物(上游序列為:5’CACTTTGGTTCCTGATGGCTT 3’;下游序列為:5’CTCCCAAGCCCAGCTTTCCAAAGG 3’)，SYBR Green PCR master mix(上海基康生物技術(shù)有限公司)。反應(yīng)條件:94℃變性4min，然后94℃15s，60℃30s，再72℃40s，共40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。GAPDH 為內(nèi)參照，每個(gè)樣本的每個(gè)待測(cè)項(xiàng)目均測(cè)3次，取平均值。記錄各樣品的Ct值，并計(jì)算各組目的基因的相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算公式為:△CtFAM83A=CtFAM83A－CtGAPDH;△△Ct=△Ct腫瘤－△Ct正常人平均值;目的基因的相對(duì)量 Q為:2－ΔΔCt。將特異性為100%時(shí)的－△Ct值作為界限值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。乳腺癌病例對(duì)照的比較采用t檢驗(yàn)，病例按臨床病理特征分組后不同組的比較采用方差分析。

2 結(jié)果

表1 乳腺癌外周血FAM83A表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系(mean±SD)

2.1 乳腺癌外周血高表達(dá)基因FAM83A的鑒定:在 SAGE文庫(kù)中，比對(duì)出在10bp的短標(biāo)簽文庫(kù)(short tags)和17bp的長(zhǎng)標(biāo)簽文庫(kù)(long tags)中共同出現(xiàn)的基因，最終篩選出22個(gè)在乳腺癌中高表達(dá)的基因。其中FAM83A高度差異表達(dá)，并經(jīng)RT－PCR驗(yàn)證其在10乳腺癌外周血標(biāo)本中有5例表達(dá)，而10例正常人外周血中無(wú)1例表達(dá)，可作為外周血檢測(cè)乳腺癌的標(biāo)記物。

2.2 乳腺癌外周血FAM83A的表達(dá)水平:實(shí)時(shí)半定量巢式PCR檢測(cè)外周血FAM83A mRNA表達(dá)水平，測(cè)得乳腺癌組患者－△Ct為 3.84±2.2，顯著高于正常組－△Ct(－8.11±2.5)，P＜0.001，見(jiàn)圖 1。乳腺癌患者FAM83A mRNA 相對(duì)表達(dá)量為:53.24±22.7。根據(jù)界限值，得到FAM83A在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為40.5%(34/84)。

2.3 FAM83A表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系:外周血腫瘤標(biāo)記物FAM83A表達(dá)與臨床分期(P＜0.001)、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移(P=0.001)和 ER(P=0.001)、PR(P=0.038)、HER2(P=0.001)相關(guān)。而與年齡(P=0.338)、病理類型(P=0.898)和腫瘤大小(P=0.056)無(wú)相關(guān)性。詳見(jiàn)表1。

圖1 FAM83A在乳腺癌和正常組外周血中的表達(dá)比較

3 討論

大部分乳腺癌患者均經(jīng)歷手術(shù)為主的綜合治療，但許多病例甚至相當(dāng)部分早期患者仍出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞在術(shù)前或術(shù)中已脫離原發(fā)灶，以非常少的數(shù)量轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)、骨髓、血液或遠(yuǎn)處器官中，普通的檢測(cè)手段卻不能發(fā)現(xiàn)，稱為“腫瘤微轉(zhuǎn)移”［3］。通過(guò)檢測(cè)血液循環(huán)中癌細(xì)胞，可發(fā)現(xiàn)最低限度殘留病灶，提高腫瘤分期的準(zhǔn)確性，對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移與否和預(yù)后判斷有重要意義，而且還可了解綜合治療療效，指導(dǎo)進(jìn)一步治療。及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤的血行播散并給予有效治療，將有助于殺滅血中播散的腫瘤細(xì)胞，減少日后轉(zhuǎn)移性腫瘤的發(fā)生，改善預(yù)后，提高生存率［4］。但由于播散到外周血中的實(shí)體腫瘤細(xì)胞數(shù)目非常少，需要高度敏感、特異的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。RT－PCR檢測(cè)特異性標(biāo)志蛋白mRNA的表達(dá)已被證明是檢查外周血、淋巴結(jié)和骨髓中循環(huán)癌細(xì)胞和檢測(cè)隱匿性癌轉(zhuǎn)移的高度敏感方法。其基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤細(xì)胞仍然表達(dá)具有起源組織特征的特異標(biāo)記，主要用于檢測(cè)實(shí)體腫瘤的微轉(zhuǎn)移。如果采用巢式PCR技術(shù)則敏感性更高，10mL全血中有10個(gè)癌細(xì)胞就能被檢測(cè)出，而常規(guī)PCR技術(shù)10mL全血中含1000個(gè)以上癌細(xì)胞時(shí)才可檢測(cè)出［5］。本實(shí)驗(yàn)，我們采用了熒光半定量巢式PCR方法，第一輪為普通PCR反應(yīng)，結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物2μL作為模板加入到第二輪體系中，而第二輪PCR檢測(cè)則采用熒光定量技術(shù)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行相對(duì)的定量檢測(cè)。這樣既保證了檢測(cè)的敏感性，又兼具有real－time PCR定量的優(yōu)勢(shì)。

有效的微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)，僅僅敏感的方法還不夠，還需要特異性好的標(biāo)志物基因。由于目前在實(shí)體瘤中尚無(wú)特異明確的腫瘤標(biāo)記物，因此，主要采用組織特異mRNA轉(zhuǎn)錄物為標(biāo)記物。生物信息學(xué)是綜合計(jì)算機(jī)科學(xué)、信息技術(shù)和數(shù)學(xué)的理論和方法來(lái)研究生物信息的交叉學(xué)科。利用現(xiàn)有的分析工具和各種公共數(shù)據(jù)庫(kù)，提供一條快速發(fā)現(xiàn)和研究新基因的新途徑。而基因表達(dá)系列分析(SAGE)是通過(guò)快速和詳細(xì)分析成千上萬(wàn)個(gè)EST(express sequenced tags)來(lái)尋找出表達(dá)豐富度不同的SAGE標(biāo)簽序列，發(fā)現(xiàn)新的未知的序列。CGAP SAGE計(jì)劃建立了SAGE數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http://cgap.nci.nih.gov/SAGE)，可以分析代表某條基因名稱的SAGE標(biāo)簽表達(dá)水平。隨著“腫瘤基因組解剖工程”的進(jìn)行，CGAP SAGE可以通過(guò)網(wǎng)站分析和展示SAGE數(shù)據(jù)，并自動(dòng)的將基因名稱和SAGE轉(zhuǎn)錄物水平聯(lián)系起來(lái)。因此，SAGE技術(shù)對(duì)于全面分析腫瘤組織基因表達(dá)譜、尋找腫瘤特異性表達(dá)新基因、發(fā)現(xiàn)腫瘤組織特異標(biāo)志物和揭示腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制發(fā)揮重要的作用［6］。本試驗(yàn)中，為了尋找檢測(cè)乳腺癌外周血循環(huán)癌細(xì)胞的腫瘤標(biāo)記物，我們?cè)赟AGE文庫(kù)中選擇了乳腺癌組織和正常白細(xì)胞兩個(gè)池。最終篩選出23個(gè)短序列標(biāo)簽和長(zhǎng)序列標(biāo)簽所共同代表的差異基因，然后用RT－PCR方法，對(duì)這些基因進(jìn)行驗(yàn)證。選取10例乳腺癌和10例正常人外周血標(biāo)本，理想的腫瘤標(biāo)記物要求在10例乳腺癌標(biāo)本中至少有兩例表達(dá)，而在10例正常人標(biāo)本中≤2例表達(dá)。研究結(jié)果顯示在篩選過(guò)程中，主要出現(xiàn)以下兩種情況:①有的腫瘤基因雖然在組織中高表達(dá)，但在外周血中檢測(cè)陽(yáng)性率非常低;②有的腫瘤基因雖然在乳腺癌外周血單個(gè)核細(xì)胞上高表達(dá)，但其在正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞上的表達(dá)也很高，因此不能作為診斷的標(biāo)記物。最后，我們得到了一個(gè)在乳腺癌外周血中高表達(dá)的新的腫瘤標(biāo)記物基因NPY1R。本文中的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了生物信息學(xué)分析的可靠性。

FAM83A是最新發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性抗原，在肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌中呈高表達(dá)，而在正常組織中均不表達(dá)。有文獻(xiàn)［1］報(bào)道其在肺癌的外周血中大約有34%的檢出率，而本研究發(fā)現(xiàn)，其在乳腺癌外周血中陽(yáng)性檢出率高達(dá)40.5%(34/84)。并且，與臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及ER、PR和HER2的水平相關(guān)，提示該腫瘤標(biāo)記物可用于輔助臨床分期，預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移的發(fā)生和指導(dǎo)乳腺癌的治療。但是，有關(guān)該基因與乳腺癌的發(fā)病機(jī)制目前尚無(wú)報(bào)導(dǎo)，有待我們進(jìn)一步研究。

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