劉愛玲，李 梅，熊麗黎

（1.江西省鄱陽湖水文局，江西星子 332800；2.江西省水文局，江西南昌 330002）

1 概述

鄱陽湖是中國最大的淡水湖。近年來，隨著湖區(qū)周邊工業(yè)經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高，各種污水流入鄱陽湖，使得水體富營養(yǎng)化越來越嚴(yán)重，藻類生長繁殖加快，影響用水質(zhì)量。因此，加強(qiáng)水體中藻類含量的監(jiān)測，對人民群眾的用水安全具有保障作用。

衡量水體中浮游植物現(xiàn)存量的方法很多，可以用藻細(xì)胞密度、生物量、葉綠素a，或其他指標(biāo)表示[1]。葉綠素a存在于所有的浮游植物中，是估算浮游植物生物量的重要指標(biāo)[2,3]。葉綠素a能吸收光能，在激發(fā)光的照射下能產(chǎn)生熒光，熒光的強(qiáng)弱與其含量有著密切的關(guān)系。

浮游植物葉綠素a的測定方法主要有分光光度法和熒光法[4]兩種，它的測定比用計(jì)數(shù)法測定藻類的數(shù)量要簡便和快捷，為目前一種常用測定藻類現(xiàn)存量的辦法[5]。

延遲熒光（Delayed Fluorescence，DF）是植物光合器官在光照停止后的發(fā)光現(xiàn)象，是活細(xì)胞的專屬特性，是光合效率的指示指標(biāo)，葉綠素在其中起關(guān)鍵作用[6]。1951年，科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)了植物光誘導(dǎo)延遲熒光現(xiàn)象[7]，其激發(fā)光譜取決于受試細(xì)胞的色素情況，此特征可以用于區(qū)別不同的藻屬，并可通過數(shù)學(xué)計(jì)算來評估群落光合中不同色群的貢獻(xiàn)率。延遲熒光技術(shù)可有效屏蔽再懸浮、死的生物和腐殖質(zhì)對測量精度的干擾，而其他熒光測量技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)。因此，延遲熒光技術(shù)已成為目前水華監(jiān)測的研究熱點(diǎn)。

匈牙利科學(xué)家利用延遲熒光技術(shù)對浮游生物的辨別與測量能力研制了DF活體浮游植物及生態(tài)環(huán)境在線監(jiān)測系統(tǒng)。通過研究光合速率、量子效率、延遲熒光強(qiáng)度、葉綠素含量及初級生產(chǎn)量之間的關(guān)系，尋找延遲熒光強(qiáng)度與葉綠素含量及初級生產(chǎn)力的關(guān)系，并通過浮游植物色素的激發(fā)光譜來辨別不同的藻屬[8]。該系統(tǒng)已在匈牙利巴拉頓湖、以色列金納雷特湖、蒂薩河（匈牙利區(qū)域）進(jìn)行了推廣應(yīng)用，并取得了較好的效果[9-12]，而在國內(nèi)尚無使用先例。

2011年，為了填補(bǔ)藻類在線監(jiān)測的空白，江西省鄱陽湖水文站引進(jìn)了DF活體浮游植物在線監(jiān)測系統(tǒng)，依托于鄱陽湖蛇山水量水質(zhì)水生態(tài)自動監(jiān)測站進(jìn)行了鄱陽湖藻類試驗(yàn)監(jiān)測研究。本研究立足于DF監(jiān)測數(shù)據(jù)中的6組熒光值，通過分析純種藻中熒光值與其葉綠素a的關(guān)系，嘗試建立葉綠素a與監(jiān)測熒光值的校準(zhǔn)公式，以便在野外監(jiān)測中予以應(yīng)用。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

在不同季節(jié)，鄱陽湖藻類優(yōu)勢種也各自不同。本研究根據(jù)鄱陽湖藻類生長現(xiàn)狀，選取具有代表性的藻種開展相關(guān)研究。以微囊藻（Microcysis aeruginosa）、魚腥藻（Anabeana）、四尾柵藻（Scenedesmus quadricanda）、卵圓隱藻（Oval Cryptophyta）、小環(huán)藻（Cyclotella）分別代表藍(lán)藻、綠藻、隱藻和硅藻，該純種藻均購自中國科學(xué)院水生生物研究所。

本研究采用的DF活體浮游植物在線監(jiān)測系統(tǒng)可識別包括藍(lán)藻、綠藻（包括綠藻、裸藻等）、硅藻（包括硅藻、金藻、黃藻等）和隱藻類4種藻類。

2.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)DF活體藻類在線監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測所得不同波長熒光值計(jì)算出不同藻類所對應(yīng)的葉綠素a值，與YSI6600所測的葉綠素a值進(jìn)行比較，并建立校準(zhǔn)公式，同時(shí)考慮監(jiān)測過程中的誤差，進(jìn)行參數(shù)調(diào)整，使校準(zhǔn)公式能夠更為精準(zhǔn)地體現(xiàn)葉綠素a狀況。

2.2.1 相關(guān)性分析

用EXCEL分析DF活體藻類在線監(jiān)測系統(tǒng)所檢測的6種不同波段熒光值與不同藻類所對應(yīng)的葉綠素a含量的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果表明兩者呈線性相關(guān)y＝ax。

2.2.2 純種藻葉綠素a和熒光值之間的校準(zhǔn)公式的建立

將純種培養(yǎng)的藍(lán)藻（微囊藻、魚腥藻）、隱藻、硅藻（小環(huán)藻）和綠藻（柵藻）配置成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品,用DF系統(tǒng)進(jìn)行檢測，同時(shí)用YSI6600測定葉綠素a含量。本研究通過分析每個(gè)樣品中6組熒光值與葉綠素a值之間的相關(guān)關(guān)系，應(yīng)用加權(quán)平均建立純藻熒光值和葉綠素 a 的校準(zhǔn)公式（y＝ax1＋bx2…fx6）。

2.2.3 混合藻葉綠素a和熒光值之間的校準(zhǔn)公式的建立

將純種藻標(biāo)準(zhǔn)樣品按一定比例混合，根據(jù)各種藻在各個(gè)波段下熒光值/葉綠素a的值，運(yùn)用加權(quán)平均，計(jì)算出各種藻在各個(gè)波段下所分配的熒光值。依次將所分配的熒光值代入單種藻的校準(zhǔn)公式中，并將計(jì)算結(jié)果與實(shí)際檢測值進(jìn)行對比，找出測定值與計(jì)算值之間的相關(guān)關(guān)系，將新的a值（a＇）代入公式中得到 y＝a＇（ax1＋bx2…fx6）， 得到混合藻中熒光值和葉綠素a的校準(zhǔn)公式。

2.3 校準(zhǔn)公式在野外監(jiān)測中的應(yīng)用

DF活體藻類在線監(jiān)測系統(tǒng)在使用過程中其結(jié)果受到泥沙、光照等因素的影響，為了減少監(jiān)測誤差，我們將野外監(jiān)測結(jié)果中的熒光值代入所建立的公式中，計(jì)算相應(yīng)的葉綠素a，并與實(shí)際檢測值進(jìn)行對比，找出計(jì)算測定值與計(jì)算值之間的相關(guān)關(guān)系，將新的a值（a″）代入公式中得到 y＝a″a＇（ax1＋bx2…fx6），得到野外監(jiān)測過程中熒光值和葉綠素a的校準(zhǔn)公式。

3 結(jié)果分析

3.1 純種藻葉綠素a及其熒光值的校準(zhǔn)公式

圖1是廠家根據(jù)DF活體藻類分析儀測定純種藻的熒光值，以及各個(gè)樣品的葉綠素a值和其他經(jīng)驗(yàn)值，所作出的不同藻類在不同波段下熒光值/葉綠素a的關(guān)系，反映了在不同波段下，每種藻中單位葉綠素a含量所占的熒光值。

圖1 不同熒光值與純種藻葉綠素a的關(guān)系圖

由圖1可知，同一波段下不同的藻類，熒光值對葉綠素a的貢獻(xiàn)是有很大差異的。

在圖1的基礎(chǔ)上研究不同的藻類在不同波段下熒光值與葉綠素a值的相關(guān)關(guān)系。在研究相關(guān)關(guān)系時(shí)，分別以 y1，y2， y3，y4，y5分別表示微囊藻、魚腥藻、柵藻、隱藻和硅藻的葉綠素 a 值，x1，x2，x3，x4，x5和x6分別表示熒光種類 SB、B、TG、YG、R和SR對應(yīng)的各個(gè)波段熒光值。以柵藻為例，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果（見表1），計(jì)算出不同波段熒光值與葉綠素a的關(guān)系（見表2）。從表2可以看出熒光值與葉綠素a之間呈線性相關(guān)，相關(guān)關(guān)系較好。根據(jù)計(jì)算出的線性關(guān)系，結(jié)合圖1顯示的各波段熒光與葉綠素a關(guān)系，通過加權(quán)平均，建立柵藻葉綠素a（y）與各個(gè)波段熒光值（x）的線性關(guān)系。

采用同樣方法可建立其他藻類葉綠素a與各個(gè)波段熒光值的校準(zhǔn)公式，結(jié)果如下：

微囊藻：y1＝0.00067x1＋0.0005x2＋0.00033x3＋0.00017x4＋0.00017x5＋0.00017x6

魚 腥 藻 ：y2＝0.0031x1＋0.71 ×0.0022x2＋0.0029x3＋1.54×0.0047x4＋0.0032x5＋0.66×0.0021x6

隱藻：y4＝0.0042x1＋ 0.74×0.0031x2＋0.82×0.0035x3＋1.26×0.0052x4＋1.21×0.005x5＋0.0038x6

硅 藻 ：y5＝0.0027x1＋0.62×0.0018x2＋0.67×0.0020x3＋1.68×0.0040x4＋1.17×0.0030x5＋0.55×0.0016x6

表1 不同濃度柵藻熒光值與葉綠素a原始檢測值

表2 不同熒光值與柵藻葉綠素a的關(guān)系

2.2 混合藻葉綠素a及其熒光值的校準(zhǔn)公式

將DF測得的混合藻樣品熒光結(jié)果代入所建公式中進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表3。與儀器測定的葉綠素a結(jié)果相差較大。所以要確定混合藻中各種藻的葉綠素a（y）與熒光值（x）的相關(guān)關(guān)系，需要進(jìn)一步校準(zhǔn)相關(guān)參數(shù)。

根據(jù)圖1中各種藻在各個(gè)波段下熒光值/葉綠素a的值，計(jì)算出每種藻中每份葉綠素所占熒光值占該波段總熒光值的比例，結(jié)果見表4。

將所計(jì)算出的比例代入混合藻的熒光值中，計(jì)算各種藻在各個(gè)波段下所分配的熒光值。依次將各種藻在各個(gè)波段所分配的熒光值代入單種藻的校準(zhǔn)公式中，重新計(jì)算各種藻相應(yīng)的葉綠素a含量，與實(shí)際葉綠素a含量進(jìn)行比較，結(jié)果見表5。

由表5可知，根據(jù)公式計(jì)算出來的葉綠素a值測定值有一定差異，需要進(jìn)一步對其校準(zhǔn)參數(shù)進(jìn)行分析。在此，建立各種藻中葉綠素a計(jì)算值與實(shí)際值相關(guān)曲線，詳見圖2至圖5。微囊藻、魚腥藻、柵藻、隱藻的線性參數(shù)分別為4.116、0.5955、1.4336、0.7206，因此，混合藻中微囊藻、魚腥藻、柵藻和隱藻的葉綠素a與熒光值的校準(zhǔn)公式分別調(diào)整為：

表3 方程計(jì)算的葉綠素a與測定值結(jié)果對比 μg/L

表4 各種藻占總熒光值的比例%

表5 葉綠素a方程計(jì)算值與測定值結(jié)果對比 μg/L

圖2 微囊藻中葉綠素a計(jì)算值與實(shí)際值相關(guān)關(guān)系

圖3 魚腥藻中葉綠素a計(jì)算值與實(shí)際值相關(guān)關(guān)系

圖4 柵藻中葉綠素a計(jì)算值與實(shí)際值相關(guān)關(guān)系

圖5 隱藻中葉綠素a計(jì)算值與實(shí)際值相關(guān)關(guān)系

4 校準(zhǔn)公式在野外監(jiān)測中的應(yīng)用

為驗(yàn)證所建立的校準(zhǔn)公式在野外監(jiān)測結(jié)果中的應(yīng)用效果，本次試驗(yàn)選取了2012年某時(shí)段連續(xù)8 d的監(jiān)測結(jié)果，分別應(yīng)用校準(zhǔn)公式計(jì)算出相應(yīng)的微囊藻、魚腥藻、柵藻和隱藻的葉綠素a值，并將結(jié)果相加，與多參數(shù)水質(zhì)分析儀同步監(jiān)測的葉綠素a值進(jìn)行比較見表6。

由于校準(zhǔn)公式是建立在純培養(yǎng)藻類的基礎(chǔ)上，沒有考慮任何外界環(huán)境如泥沙等的影響，而且也沒有加上硅藻的葉綠素a值。而鄱陽湖水體含沙量高，湖水中的泥沙，TSS等極大的干擾了DF儀對藻類的測定。因此，為了找到這些因素的影響參數(shù)，將計(jì)算的葉綠素a值與多參數(shù)水質(zhì)分析儀測定的葉綠素a值建立相關(guān)曲線，如圖3。

將圖3中得到的野外校準(zhǔn)參數(shù)0.0386為系數(shù)，加入校準(zhǔn)公式，則野外監(jiān)測下葉綠素a與熒光值的校準(zhǔn)公式調(diào)整為：

利用校準(zhǔn)公式計(jì)算得到的葉綠素a結(jié)果見表6，與多參數(shù)水質(zhì)分析儀測定的葉綠素a建立相關(guān)曲線，見圖4。由圖可見，加入野外校準(zhǔn)參數(shù)后，計(jì)算出的葉綠素a值與實(shí)際測定值相關(guān)曲線斜率已經(jīng)接近 1，R2為0.7787，表明實(shí)測數(shù)據(jù)和計(jì)算數(shù)據(jù)具有較強(qiáng)的相關(guān)性，表明所建立的校準(zhǔn)公式經(jīng)調(diào)整后可以適用于野外監(jiān)測。

表6 野外監(jiān)測中方程計(jì)算的葉綠素a和YSI6600監(jiān)測結(jié)果 μg/L

圖3 方程計(jì)算的葉綠素a值與野外實(shí)測值相關(guān)關(guān)系圖

圖4 野外校準(zhǔn)公式計(jì)算的葉綠素a與測定值關(guān)系圖

4 結(jié)論

DF活體藻類在線監(jiān)測系統(tǒng)所檢測的6種不同波段熒光值與不同藻類對應(yīng)的葉綠素a值呈線性相關(guān)。該系統(tǒng)在匈牙利等國家使用過程中取得良好的效果，但是DF活體藻類在線監(jiān)測系統(tǒng)在使用過程中其結(jié)果受到不同藻類熒光遮擋的影響以及泥沙、光照等水文氣象因素的影響。在不同的地方熒光強(qiáng)度與葉綠素a之間的計(jì)算參數(shù)是不一樣的。我們通過多次校準(zhǔn)獲得符合鄱陽湖實(shí)際情況的參數(shù)，初步實(shí)現(xiàn)了DF活體藻類在線監(jiān)測系統(tǒng)在鄱陽湖葉綠素a自動監(jiān)測過程中的使用。

系統(tǒng)在使用過程中應(yīng)盡量調(diào)整參數(shù)至精準(zhǔn)，使用者可通過所在地的實(shí)際情況和監(jiān)測數(shù)據(jù)按照本文介紹的方法來進(jìn)行參數(shù)調(diào)整，得出符合實(shí)際的校準(zhǔn)方程。該系統(tǒng)具有進(jìn)一步在其它河流湖泊推廣應(yīng)用的價(jià)值。

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