趙 月，畢丁仁，* ，李自力，* ，王振豹，崔惠娟，高小聰，于 洋，周祖濤，劉 梅，，金 卉，，王香萍

(1．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070;2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

近年來，畜禽舍氣源性傳染病的爆發(fā)流行以及畜禽糞便隨意排泄導(dǎo)致的土壤污染問題日益嚴(yán)重，不僅給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，而且威脅公民的健康和公共安全［1－3］。養(yǎng)殖場(chǎng)周圍的土壤環(huán)境污染問題越來越受到人們的關(guān)注，土壤一旦被污染，其組成和理化性質(zhì)等均會(huì)發(fā)生變化。不僅破壞其自身的正常功能，而且可通過土壤中病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)散等過程對(duì)地下水造成污染以致對(duì)人體健康構(gòu)成危害［4－6］。因此，養(yǎng)殖場(chǎng)污染土壤的治理與修復(fù)就顯得至關(guān)重要，土壤治理仍成為當(dāng)前面臨的一大難題［9－10］。雖然國(guó)內(nèi)外已有較多報(bào)道從不同方面對(duì)土壤中病原菌的控制進(jìn)行了相關(guān)研究，且用于病原微生物的化學(xué)消毒劑種類也較多［7－8］，但針對(duì)被污染土壤的可大規(guī)模推廣應(yīng)用且對(duì)環(huán)境影響較小的消毒劑相關(guān)研究鮮有報(bào)道，本研究通過對(duì)湖北省部分地區(qū)雞場(chǎng)內(nèi)的污染土壤進(jìn)行調(diào)查分析，了解土壤受污染情況，同時(shí)應(yīng)用戊二醛和二氧化氯消毒劑對(duì)雞場(chǎng)土壤所分離的大腸桿菌進(jìn)行消毒試驗(yàn)，為今后用于土壤治理的化學(xué)消毒劑的選擇使用提供依據(jù)。

1 材料

1．1 供試土樣 于2009～2010年采集于湖北省漢川、鐘祥、江夏等地養(yǎng)雞場(chǎng)雞舍附近土壤。

1．2 主要試劑 卵磷脂、25%戊二醛等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂和各種微量生化反應(yīng)管，杭州微生物試劑有限公司;TSB、TSA培養(yǎng)基，BD公司。胰蛋白胨，酵母浸出物，OXOID公司;瓊脂粉，BIOSHARP公司。月桂基硫酸鹽胰蛋白培養(yǎng)基和煌綠乳糖膽鹽培養(yǎng)基，上海盛思生化科技有限公司;二氧化氯，湖南坤源股份有限公司。

2 方法

2．1 土壤中污染指標(biāo)的檢測(cè)方法

2．1．1 土壤中異養(yǎng)菌含量檢測(cè) 參照參考文獻(xiàn)［11］

方法，通過將所采集土壤樣品制成不同稀釋度的稀釋液，涂布TSA平板，37℃培養(yǎng)18～24 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)稀釋度即可計(jì)算出土壤樣品中含菌數(shù)。

2．1．2 土壤中大腸菌群含量檢測(cè) 制備一系列稀釋度的土壤菌懸液，方法同上。參照參考文獻(xiàn)［17］通過無菌吸取1 mL土壤菌懸液先接種月桂基硫酸鈉胰蛋白胨肉湯(LST)，再取一菌環(huán)接種至黃綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)，最后將陽性管菌液接種伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌鑒定。將經(jīng)過LST－BGLB兩步發(fā)酵之后，并且分離培養(yǎng)有大腸桿菌的陽性管數(shù)記錄，對(duì)照MPN三次重復(fù)表查看結(jié)果。

2．1．3 土壤中大腸桿菌含量檢測(cè) 取不同稀釋度的土壤懸液100μL涂布麥康凱平板，37℃培養(yǎng)18～24 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)稀釋度可大致估算土壤中大腸桿菌含量。

2．1．4 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 判定土壤污染程度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有兩種，即根據(jù)土壤細(xì)菌總數(shù)或大腸菌值進(jìn)行評(píng)價(jià)［12］。大腸菌值是指能檢出大腸桿菌的最小土壤量(單位:g)。比較清潔的土壤，每克細(xì)菌總數(shù)在一萬左右;嚴(yán)重污染的土壤，細(xì)菌總數(shù)可達(dá)數(shù)百萬。清潔土壤中大腸菌值＞1．0;輕度污染土壤大腸菌值1．0～0．01;中度污染土壤大腸菌值 0．01 ～0．001;嚴(yán)重污染土壤大腸菌值 ＜0．001。

2．2 雞場(chǎng)土壤大腸桿菌的分離鑒定

2．2．1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及純化 無菌操作取100μL土壤菌懸液涂布麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h。挑取陽性菌落接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h。陽性菌落接種于普通瓊脂平板上分區(qū)劃線進(jìn)行擴(kuò)大純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18～24 h后，對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鑒定。

2．2．2 生化試驗(yàn) 按常規(guī)方法進(jìn)行單糖發(fā)酵、吲哚、MR和VP試驗(yàn)等生化試驗(yàn)。

2．2．3 致病性試驗(yàn) 參照參考文獻(xiàn)［13］方法將所分離菌株的24 h肉湯培養(yǎng)物用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌濃度為1．0×108CFU/mL，經(jīng)腹腔注射接種25～30 g小鼠，每只0．2 mL，接種3只。接種后開始記錄發(fā)病與死亡情況。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，從心臟和肝臟進(jìn)行細(xì)菌復(fù)分離與鑒定。

2．3 消毒劑對(duì)大腸桿菌的殺滅效果試驗(yàn)

2．3．1 分離株菌懸液的制備 試驗(yàn)使用菌種第3～16代的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物，吸取5．0 mL滅菌1×PBS加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹洗以便洗下菌苔。將細(xì)菌懸液轉(zhuǎn)移至另一無菌EP管中，漩渦混合30 s至1 min，即為所使用細(xì)菌懸液。

2．3．2 中和劑鑒定試驗(yàn) 按消毒技術(shù)規(guī)范［14］規(guī)定的中和劑鑒定試驗(yàn)程序設(shè)計(jì)4組試驗(yàn)，以大腸桿菌漢川雞場(chǎng)分離株為試驗(yàn)菌，分別對(duì)兩種消毒劑最高使用濃度進(jìn)行中和劑鑒定，符合判斷標(biāo)準(zhǔn)者作為相應(yīng)中和劑。判斷標(biāo)準(zhǔn)為:第1、2和3組有相似量試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，平皿培養(yǎng)生長(zhǎng)菌量在30 CFU/mL～300 CFU/mL之間，且組間菌落數(shù)誤差率不超過15%;第4組無菌生長(zhǎng)。符合上述標(biāo)準(zhǔn)即為所用中和劑及其濃度為合格。

2．3．3 定量懸浮消毒試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法［14］分組。(1)試驗(yàn)組:臨用前取0．5 mL試驗(yàn)菌懸液(5×106CFU/mL～5×107CFU/mL)于試管中，加入0．5 mL 30 g/L的 BSA。置于20℃ ±1℃水浴5 min后，加入4．0 mL待測(cè)濃度的戊二醛(二氧化氯)，混勻后作用至預(yù)定時(shí)間，取0．5 mL試驗(yàn)菌與消毒劑混合液加至4．5 mL相應(yīng)中和劑中，混勻后水浴作用10 min。分別取0．1 mL涂布三個(gè)麥康凱瓊脂平板。37℃恒溫培養(yǎng)16～24 h后觀察并計(jì)數(shù)并計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值。(2)陽性對(duì)照組:與試驗(yàn)組相似，以標(biāo)準(zhǔn)硬水代替戊二醛(二氧化氯)消毒劑進(jìn)行試驗(yàn)。(3)陰性對(duì)照組:取當(dāng)次試驗(yàn)所用中和劑、1×PBS、標(biāo)準(zhǔn)硬水各1．0 mL于同一EP管內(nèi)，分別取0．1 mL涂布三個(gè)麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16～24 h后觀察。

2．3．4 以土壤為載體的消毒試驗(yàn) 參照參考文獻(xiàn)［8］方法分組。(1)試驗(yàn)組:取1 mL菌液(1×106CFU/mL－1×108CFU/mL)加入放有4 g土壤的滅菌平皿內(nèi)混勻。加入5 mL已知濃度的戊二醛(二氧化氯)作用至預(yù)定時(shí)間，取0．5 g試驗(yàn)菌、消毒劑及土壤混合液加至4．5 mL相應(yīng)中和劑中，混勻后作用10 min。取0．1 mL涂布三個(gè)麥康凱瓊脂平板，于37℃恒溫培養(yǎng)16～24 h后觀察計(jì)數(shù)并計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值。(2)陽性對(duì)照組:以標(biāo)準(zhǔn)硬水代替消毒劑進(jìn)行試驗(yàn)。(3)陰性對(duì)照組:參見定量懸浮試驗(yàn) 2．3．3。

2．3．5 數(shù)據(jù)處理 計(jì)算各組的活菌濃度N(CFU/mL)，并換算為對(duì)數(shù)值，按下式計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值:殺滅對(duì)數(shù)值(KL)=對(duì)照組平均活菌的對(duì)數(shù)值(lgN0)/試驗(yàn)組活菌濃度對(duì)數(shù)值(lgNt)。

3 結(jié)果與分析

3．1 湖北省養(yǎng)雞場(chǎng)污染情況調(diào)查結(jié)果 通過對(duì)2009～2010年在湖北省漢川、江夏等地采集的養(yǎng)雞場(chǎng)土壤菌含量進(jìn)行測(cè)定并對(duì)其污染情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。所測(cè)定雞場(chǎng)土壤都有不同程度的污染，且春秋兩季土壤污染較夏冬兩季嚴(yán)重(表1、表2)。

表1 土壤污染情況(大腸菌值)

表2 土壤污染情況(土壤總菌含量)

3．2 分離菌株的鑒定

3．2．1 培養(yǎng)特性及形態(tài)特征 分離菌株在各培養(yǎng)基上呈現(xiàn)典型大腸桿菌菌落特征:在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上形成圓形隆起、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)、半透明且近似灰白色的菌落。在麥康凱瓊脂上形成圓形隆起、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)且直徑約2．0 mm紅色菌落;在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成圓形隆起、表面光滑、中央呈紫黑色且對(duì)光觀察具有金屬光澤、直徑約2～3 mm的菌落。分離菌為革蘭氏陰性、無芽胞短桿菌，多單個(gè)散在或成對(duì)分布，符合大腸桿菌的形態(tài)特征。

3．2．2 生化鑒定結(jié)果 結(jié)果顯示該分離菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和山梨醇，不發(fā)酵蔗糖，不液化明膠，吲哚試驗(yàn)和MR試驗(yàn)均為陽性;VP試驗(yàn)陰性，初步判定為大腸桿菌。

3．2．3 致病性試驗(yàn)結(jié)果 接種分離菌株的三只小鼠在接種后48～72 h全部死亡，剖解未見明顯病理變化。從死亡小鼠的心臟和肝臟均可分離到接種菌。復(fù)分離培養(yǎng)與生化鑒定結(jié)果均與接種菌一致。

3．3 消毒劑對(duì)大腸桿菌分離株殺滅效力測(cè)定

3．3．1 中和劑試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明采用中和劑10 g/L 吐溫－80配合10 g/L甘氨酸與5 g/L卵磷脂的PBS溶液，能夠中和0．02%戊二醛對(duì)大腸桿菌的殺滅作用;采用中和劑5 g/L硫代硫酸鈉與8 g/L吐溫－80的PBS溶液，能夠中和400 mg/L二氧化氯對(duì)大腸桿菌的殺滅作用，且中和劑與中和產(chǎn)物對(duì)指示菌生長(zhǎng)均無明顯影響，符合中和劑鑒定試驗(yàn)要求各項(xiàng)指標(biāo)。戊二醛和二氧化氯中和劑鑒定結(jié)果見表3和表4。

表3 戊二醛殺滅大腸桿菌中和劑鑒定結(jié)果

表4 二氧化氯殺滅大腸桿菌中和劑鑒定結(jié)果

3．3．2 定量懸浮消毒試驗(yàn)結(jié)果 戊二醛和二氧化氯定量懸浮消毒試驗(yàn)結(jié)果分別見表5和表6。從表5可以看出，0．02%戊二醛作用5 min或0．01%戊二醛作用30 min對(duì)大腸桿菌的殺滅率均可達(dá)到100%，而0．05%戊二醛作用60 min才能完全殺滅大腸桿菌。從表6可以看出，50 mg/L與100 mg/L二氧化氯作用2min對(duì)大腸桿菌的殺滅率均可達(dá)到100%，而25 mg/L二氧化氯作用10 min才能完全殺滅大腸桿菌。

表5 戊二醛對(duì)大腸桿菌的殺滅效果(存活對(duì)數(shù)值)

表6 二氧化氯對(duì)大腸桿菌的殺滅效果(存活對(duì)數(shù)值)

3．3．3 以土壤為載體的消毒試驗(yàn)結(jié)果 戊二醛和二氧化氯土壤載體消毒試驗(yàn)結(jié)果分別見表7和表8。從表7可以看出，0．02%戊二醛作用10 min或0．01%戊二醛作用30 min對(duì)大腸桿菌的殺滅率均可達(dá)到100%，而0．0025%戊二醛作用60 min也未能完全殺滅大腸桿菌。從表8可以看出，400 mg/L二氧化氯作用10 min或300 mg/L二氧化氯作用30 min對(duì)大腸桿菌的殺滅率均可達(dá)到100%;而200 mg/L二氧化氯即使作用60 min也未能完全殺滅大腸桿菌。

表7 戊二醛對(duì)大腸桿菌的殺滅效果(存活對(duì)數(shù)值)

表8 二氧化氯對(duì)大腸桿菌的殺滅效果(存活對(duì)數(shù)值)

4 討論

無論以總菌含量還是以大腸菌值為標(biāo)準(zhǔn)，土壤污染程度均表現(xiàn)出春秋兩季高于夏冬兩季。春秋兩季土壤污染嚴(yán)重可能和季節(jié)氣候相關(guān)，一般春秋兩季適宜的氣候條件適宜大多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)，而夏季高溫、冬季寒冷一般不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，這可能是造成土壤中細(xì)菌乃至病原菌數(shù)量較多的原因之一。同時(shí)，養(yǎng)殖場(chǎng)畜禽在春秋兩季發(fā)病情況也會(huì)有所增加，可能通過氣溶膠等進(jìn)行病原菌的傳播，從而造成土壤中病原菌含量的相對(duì)增加。因此，在適宜病原菌生長(zhǎng)的春秋季節(jié)尤其要加強(qiáng)雞舍乃至附近土壤的消毒工作，防止病原菌進(jìn)一步擴(kuò)散。

化學(xué)消毒劑因其廣譜消毒性在畜牧生產(chǎn)中對(duì)于控制病原微生物的傳播、預(yù)防和治理流行疾病具有非常積極的意義［15］。王靜等通過對(duì)規(guī)?；u場(chǎng)消毒前后結(jié)果表明，消毒后雞舍內(nèi)空氣中細(xì)菌含量明顯降低，減少了疫病發(fā)生的可能［16］。但目前有關(guān)對(duì)土壤病原菌進(jìn)行消毒殺滅的研究還很少［10］。王莉等研究了四種消毒劑對(duì)土壤中污染的霍亂弧菌的殺滅效果，500 mg/L(有效氯)作用3 min即可殺滅田土中的霍亂弧菌［8］。廖駿等研究也表明，幾種含氯消毒劑對(duì)土壤中埃爾托弧菌具有良好的殺滅效果。這些都與本研究中二氧化氯具有較強(qiáng)的殺滅效果相一致［18］。研究應(yīng)用戊二醛和二氧化氯的定量懸浮試驗(yàn)和以土壤為載體的消毒試驗(yàn)都表明這兩種消毒劑均具有良好的消毒效果，但土壤的存在明顯降低了消毒劑的殺菌效力。此次試驗(yàn)由于土壤載體的量小，故其消毒效果尚需進(jìn)一步通過田間試驗(yàn)來加以驗(yàn)證，但仍具有一定的指導(dǎo)意義，建議針對(duì)雞場(chǎng)污染土壤中的大腸桿菌可選擇0．02%戊二醛或400 mg/L二氧化氯進(jìn)行消毒處理。在養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)際應(yīng)用過程中，還應(yīng)根據(jù)具體情況適當(dāng)調(diào)整所用消毒劑的種類和濃度以達(dá)到最佳殺菌效果，從而保證土壤的安全潔凈，有效控制疾病的流行、蔓延，保障人類的健康。

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