張奎花， 錢秀娟， 劉長仲

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，蘭州 730070）

昆蟲病原線蟲共生菌是存在于昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)的一類特殊細(xì)菌，與線蟲互利共生。將線蟲作為載體進(jìn)入寄主昆蟲體內(nèi)，在昆蟲血腔內(nèi)大量繁殖，并產(chǎn)生抑菌物質(zhì)和毒素，使寄主昆蟲患敗血癥死亡；同時共生菌分解寄主組織，為線蟲提供生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)；此外共生菌還產(chǎn)生抗生素，抑制其他雜菌的生長，為昆蟲病原線蟲提供理想的生長環(huán)境。目前，多種害蟲如玉米螟、小菜蛾等對世界上使用量最大的微生物殺蟲劑Bt產(chǎn)生抗性［1］，而轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因植物的大面積推廣應(yīng)用將會加速抗性的發(fā)展，因此篩選和發(fā)掘新的微生物殺蟲資源具有重要意義［2］。已有研究報道，Bowen［3］從發(fā)光桿菌（Photorhabdusluminescea）W－14菌株中分離純化出一種對多種害蟲具有胃毒作用的高分子量外毒素蛋白復(fù)合體，同時克隆出表達(dá)這些毒素蛋白的基因，使昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌的研究成為人們關(guān)注的熱點，并為開發(fā)新的殺蟲基因和殺蟲毒素蛋白提供了新途徑［4］。昆蟲病原線蟲作為一種最具潛力的生物防治因子具有殺蟲效果好、殺蟲譜廣、安全性高［5－8］等優(yōu)點，研究其共生菌可以為開發(fā)研究新型微生物殺蟲劑提供依據(jù)，為害蟲生物防治提供新方法和新途徑［9］。由于甘肅省特殊的地理環(huán)境，干旱少雨、海拔高、紫外線強，引進(jìn)的昆蟲病原線蟲適應(yīng)性較差［10］，本研究選用從甘肅省29個線蟲種群中篩選的4個優(yōu)良品系［11］中分離的共生菌，研究紫外燈、日光照射、不同溫度及不同發(fā)酵時間等因子對大蠟螟5齡幼蟲殺蟲活性的影響，為研究開發(fā)新的殺蟲基因及殺蟲資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試共生菌

斯氏線蟲［Steinernemakraussei（Steiner）］的0657L和0622L品系，S.affine（Bovien）的0664YM品系中分別分離得到嗜線蟲致病桿菌（Xenorhabdus）SKX0657、SKX0622和SAX0664；異小桿線蟲［Heterorhabditismegidis（Poinar）］的0627M 品系分離得到發(fā)光桿菌（Photorhabdus）HMP0627，昆蟲病原線蟲由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)學(xué)實驗室提供。

1.2 供試?yán)ハx

大蠟螟（GalleriamellonellaLinnaeus）由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)實驗室提供。

1.3 供試培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂45 g，酵母提取物5 g，水1 000 m L。

鑒別培養(yǎng)基（NBTA）：營養(yǎng)瓊脂45 g，紅四氮唑（TTC）0.025g，溴百里酚藍(lán)（BTB）0.04g，水1000mL。

TSY培養(yǎng)基：胰大豆肉湯40 g，酵母提取物5 g，蒸餾水1 000 m L。

1.4 共生菌的分離

用昆蟲病原線蟲侵染健康的大蠟螟5齡幼蟲，16～24 h后分離共生細(xì)菌。用75%的乙醇給大蠟螟表面消毒，剪去第3對腹足頂端，將流出的含有共生菌的體液滴在NA培養(yǎng)基上，用接種針畫線，倒置放在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［12］，24 h左右平板上出現(xiàn)單菌落，挑取單菌落接到NBTA平板上純化，純化后接入TSY培養(yǎng)液中，在180 r／min，25℃的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)48 h。取7 m L菌懸液、3 m L甘油，按這種配比將混合液分裝在滅菌離心管中，放在－80℃的冰箱中保存［13］。

1.5 共生菌發(fā)酵液的制備

將保存的共生細(xì)菌畫線于NA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落，再畫線于NBTA平板上，25℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落接入TSY培養(yǎng)基中，于180 r／min、25℃恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)48 h，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 不同溫度對共生菌殺蟲活性的影響

將活化的細(xì)菌發(fā)酵液以5%接菌量接入100 m L TSY培養(yǎng)液中，于180 r／min、25℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液放于30、50、70、100 ℃水浴中，10 min后取出作為供試樣，每一溫度設(shè)同樣處理的無菌發(fā)酵液為陰性對照（CK），并以未作任何處理的共生菌發(fā)酵液為陽性對照（常溫25℃），以大蠟螟5齡幼蟲為生測昆蟲。稱取1 g人工飼料放在60 mm培養(yǎng)皿中，將發(fā)酵液以100μL／g的比例與人工飼料混勻，每皿放一頭饑餓24 h的大蠟螟5齡幼蟲，每一供試樣處理10頭大蠟螟，重復(fù)3次。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔24 h檢查試蟲的死亡情況，連續(xù)檢查5 d，5 d后記錄幼蟲存活數(shù)，稱活蟲體重，計算校正死亡率和體重抑制率。其中，校正死亡率（%）＝（處理死亡率－對照死亡率）×100／（1－對照死亡率），體重抑制率（%）＝（對照試蟲體重－處理試蟲體重）×100／（對照試蟲體重－初孵幼蟲體重）。

1.7 紫外燈照射和日照對共生菌殺蟲活性的影響

將裝有100 mL發(fā)酵液的250 mL三角瓶培養(yǎng)48 h后，分別暴露于18 W紫外燈下30 cm處照射5、10、20、30、60、120 min和7月28日正午1.999 mmol／（m2·s）日光下照射1 h后作為供試樣，每一個供試樣為一個處理，每一處理設(shè)同樣處理的無菌發(fā)酵液為對照，并以未作任何處理的共生菌發(fā)酵液為對照（常溫25℃），以大蠟螟5齡幼蟲為生測昆蟲。按1.6的方法進(jìn)行生物測定，每隔24 h檢查幼蟲死亡情況，5 d后記錄存活蟲的體重和數(shù)量，計算校正死亡率和體重抑制率。

1.8 不同培養(yǎng)時間對共生菌殺蟲活性的影響

將活化的細(xì)菌發(fā)酵液以5%接菌量接入100 m L TSY培養(yǎng)基中，于180 r／min、25℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)48 h，每隔4 h取樣，以不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵液為供試樣品，設(shè)無菌發(fā)酵液為對照。按1.6的方法進(jìn)行生物測定，計算體重抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對共生菌殺蟲活性的影響

不同線蟲品系共生菌對大蠟螟胃毒活性存在顯著差異（圖1）。在常溫下異小桿線蟲共生菌HMP0627對大蠟螟的胃毒活性最高，平均校正死亡率為22.20%，平均體重抑制率為36.02%，顯著高于其他共生菌。斯氏線蟲共生菌SAX0664對大蠟螟也有較高的致死作用。

溫度對共生菌的胃毒活性有顯著影響。25℃下，各線蟲品系共生菌對大蠟螟的平均體重抑制率和校正死亡率均最高，分別為28.05%～36.02%和4.44%～22.20%，顯著高于其他溫度處理。30℃處理10 min后，各線蟲品系共生菌對大蠟螟5齡幼蟲仍有較高的胃毒毒力；50℃處理后，各線蟲品系共生菌對大蠟螟的校正死亡率明顯下降，對大蠟螟的平均體重抑制率也比25℃和30℃有顯著降低，其平均體重抑制率為9.73%～27.31%，仍對大蠟螟的生長有明顯的抑制作用（表1）。70℃處理后，校正死亡率和體重抑制率均大幅度下降80%左右；100℃處理后，除HMP0627外，其他共生菌喪失胃毒毒力。此結(jié)果說明，4個線蟲品系共生菌在50℃處理10 min后，仍有一定胃毒活性。

圖1 不同種共生菌發(fā)酵液對大蠟螟的殺蟲活性Fig.1 Insecticidal activity of the fermentation broth of different symbiotic bacteria to Galleria mellonella

表1 不同溫度對共生菌殺蟲活性的影響1）Table 1 Influence of temperatures on insecticidal activities of symbiotic bacteria

2.2 紫外燈照射和日照對共生菌殺蟲活性的影響

由表2所示，日光照射和紫外燈照射對4個線蟲品系共生菌的胃毒活性均有不同程度的影響。1.999 mmol／（m2·s）日光照射1 h后，除SKX0657外，其他3個共生菌對大蠟螟的校正死亡率分別由7.78%、22.2%和15.57%降到5.75%、18.24%和10.35%；各線蟲品系共生菌的體重抑制率均顯著低于未照射組（P＜0.05）。隨著紫外燈照射時間的延長，4個線蟲品系共生菌對大蠟螟5齡幼蟲的校正死亡率呈逐漸下降的趨勢。HMP0627、SAX0664和SKX0657照射10 min，SKX0622照射20 min時，對大蠟螟5齡幼蟲的校正死亡率均顯著低于未照射組（P＜0.05），體重抑制率在照射5 min時，除SKX0657和HMP0627外，其他兩個共生菌與未照射組存在顯著差異。紫外燈照射30 min之后，各線蟲品系共生菌對大蠟螟的致死作用明顯下降，但有明顯的生長抑制作用；SKX0657在紫外燈照射60 min之后喪失殺蟲活性。

表2 紫外燈照射和光照對共生菌殺蟲活性的影響Table 2 Influence of ultraviolet ray and sunlight on insecticidal activities of symbiotic bacteria

2.3 不同培養(yǎng)時間對共生菌殺蟲活性的影響

隨著培養(yǎng)時間的延長，4個品系線蟲共生菌的胃毒活性逐漸上升，但共生菌間存在差異。X0664和X0657對大蠟螟5齡幼蟲的體重抑制率均小于SKX0622和HMP0627。SAX0664 在 24 h 時 達(dá) 到 41.70%；SKX0657在28 h時達(dá)到37.80%；而SKX0622則在36 h時達(dá)到最大值65.50%；HMP0627在40 h時達(dá)到最大值65.03%，并在24～40 h之間有較高的胃毒毒力。

圖2 不同培養(yǎng)時間對共生菌胃毒活性的影響Fig.2 Influence of culture time on insecticidal activities of symbiotic bacteria against G.mellonella

3 結(jié)論與討論

利用生物測定方法對影響昆蟲病原線蟲共生菌發(fā)光桿菌和嗜線蟲致病桿菌發(fā)酵液殺蟲活性的日光照射、紫外燈照射及溫度等因子對大蠟螟5齡幼蟲的胃毒活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，未作任何處理的發(fā)光桿菌和嗜線蟲致病桿菌共生菌發(fā)酵液對大蠟螟的胃毒活性存在顯著差異，異小桿線蟲共生菌HMP0627對大蠟螟的胃毒活性最高，校正死亡率和體重抑制率分別為22.20%和36.02%，斯氏線蟲共生菌SAX0664對大蠟螟也有較高的致死作用。經(jīng)過高溫、日光及紫外燈照射后，各線蟲品系共生菌雖有胃毒活性，但斯氏線蟲共生菌的胃毒毒力明顯低于異小桿線蟲共生菌的胃毒毒力。日光照射1 h、紫外燈照射30 min時，各線蟲品系共生菌仍有較高的胃毒毒力，HMP0627和SAX0664耐紫外線性較強，HMP0627優(yōu)于SAX0664。經(jīng)過50℃處理10 min后，HMP0627仍有較高的致死率和體重抑制率，SKX0657仍有較高的體重抑制率。不同線蟲品系共生菌在不同培養(yǎng)時間對大蠟螟的胃毒毒力不同，HMP0627對大蠟螟的體重抑制率高于其他共生菌，并且持效時間長。因此進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，應(yīng)根據(jù)不同線蟲品系共生菌選擇合適的培養(yǎng)時間。

昆蟲病原線蟲共生菌殺蟲活性物質(zhì)主要有殺蟲毒素蛋白、脂多糖類、次生代謝產(chǎn)物［1，15－17］，經(jīng)過高溫處理后，會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使其殺蟲活性受到影響。本研究結(jié)果表明，在50℃條件下，HMP0627對大蠟螟的平均體重抑制率為27.31%，仍有較高的胃毒毒力。該結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，Jarrett從伯氏嗜線蟲致病桿菌（Xenorhabdusbovienii）中分離出殺蟲毒素，這種毒素對鞘翅目、鱗翅目的多種昆蟲有毒殺作用，在50℃時依舊很穩(wěn)定［14］。王歡利用生物測定對28個線蟲品系的152個共生菌菌株進(jìn)行研究，50℃處理10 min對高毒力菌株的殺蟲活性無明顯影響［9］。溫度升高及處理時間延長可能會影響線蟲共生菌的殺蟲活性。

日光照射和紫外燈照射對大蠟螟殺蟲活性的影響不僅與照射時間有關(guān)，而且不同線蟲品系共生菌殺蟲活性也不同。照射30 min后，各線蟲品系共生菌仍有胃毒活性，這與前人研究結(jié)果存在差異，孟亞莉利用生物測定對35株共生菌菌株進(jìn)行研究，高毒力菌株經(jīng)紫外燈照射60 min后有胃毒毒力［1］。但其胃毒活性明顯小于HMP0627、SKX0622和SAX0664經(jīng)過紫外照射120 min的胃毒活性，這與甘肅省的特殊地理環(huán)境海拔高、紫外線強等有關(guān)。有關(guān)紫外照射對共生菌殺蟲活性影響的研究報道很少，究竟紫外照射還改變了哪些物質(zhì)的特性有待進(jìn)一步研究。本研究的供試菌株從甘肅省優(yōu)良線蟲品系中分離得到，因此有必要將其產(chǎn)生的物質(zhì)進(jìn)行鑒定和編碼基因，為研制開發(fā)新的微生物殺蟲劑及轉(zhuǎn)基因抗蟲植物提供理論基礎(chǔ)和基本數(shù)據(jù)，為害蟲生物防治提供新方法和新材料。

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