蘇美華,陳 平,孫 劍

(1.漳州師范學院體育系,福建漳州 363000;2.呂梁學院體育系,山西呂梁 033000;3.新疆師范大學 體育學院,新疆 烏魯木齊 830000)

骨骼肌是最直接參與運動的器官之一,運動引起組織內(nèi)抗氧化能力的改變在肌肉表現(xiàn)最為明顯.正常細胞的DNA損傷是疾病的誘因之一,而運動所致的DNA損傷也引起人們極大的興趣.因此本實驗采用單細胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)又稱彗星實驗(comet assay)來觀測力竭運動后即刻、24 h、48 h等不同時相小鼠骨骼肌細胞的DNA損傷效應(yīng),并對力竭運動所致骨骼肌氧化損傷進行測定,探討骨骼肌細胞DNA損傷機制,進一步揭示運動性疲勞的外周機制.

1 材料和方法

1.1 動物與分組

選用昆明純系清潔級健康雄性小鼠(購于北京醫(yī)科大學動物中心),7~8周齡,體重27.68±2.86 g.分籠飼養(yǎng),自由飲食,自然光照,動物室內(nèi)溫度20℃ ±2℃,相對濕度為50% ±5%.動物隨機分為對照組(CG)和運動組(SG);運動組又分為運動后即刻組(0SG)、運動后 24 h組(24SG)、運動后 48 h組(48SG),每組6只,共24只.

1.2 運動疲勞動物模型的建立

根據(jù)Marra[7]的運動方案建立運動疲勞動物模型.運動方式為電動跑臺,運動組先進行3天的適應(yīng)性訓練(速度為10 m/min,坡度為0°).休息2天,從第5天開始進行正式運動.初始速度為10 m/min,在10分鐘內(nèi)逐漸增加負荷達到28 m/min速度,一直持續(xù)到力竭.以這種運動方式持續(xù)運動6天.力竭標準:運動末期動物不能堅持原跑速,先后滯跑道后1/3處達3次以上,刺激驅(qū)趕無效,停跑后體征表現(xiàn)為呼吸急促,神情倦怠,腹臥位,對刺激反應(yīng)遲鈍.

1.3 細胞DNA損傷的測定

1.3.1 取材與制備單細胞懸液

小鼠最后一次運動至疲勞后分別在即刻、24 h、48 h脫頸處死,取骨骼肌放培養(yǎng)皿,用預(yù)冷的PBS沖洗、剪碎,再將其置于5 ml離心管內(nèi)(管內(nèi)含1500μl的PBS),然后加入終濃度0.25%的胰蛋白酶,37℃水浴30 min形成同源混濁液,用200目細胞篩過濾,制得骨骼肌細胞單細胞懸液.

1.3.2 制膠片

膠片制作參照Hartmann[8]的方法稍加改進.1.3.3 電泳和染色

將載玻片置于水平電泳槽中,倒入新配置的堿性電泳緩沖液約覆過膠面0.25 cm左右,解旋20 min,以便使DNA解螺旋成單鏈,使DNA斷片在電泳場中易于遷移.解旋后在25 V、250 mA的條件下電泳40 min.停止電泳后小心地將玻片放入中和緩沖液中中和15 min.取出玻片,滴加30~50μL濃度為5 μg/mL的EB染液到膠體表面,蓋上蓋玻片,染色15~20 min后熒光顯微鏡觀察.

1.4 抗氧化酶與脂質(zhì)過氧化水平的測定

SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法;MDA測定采用硫代巴比妥酸比色法;蛋白定量測定采用考馬斯亮藍G-250法.試劑盒均購自南京建成生物工程研究所.

1.5 主要儀器和試劑

電動動物跑臺(BCPT-98型,杭州)、DYY-6C型三恒電泳儀和DYZC-24B型電泳槽(北京,六一);BX-51型熒光顯微鏡和E-330型數(shù)碼像機(OLYMPUS).低熔點瓊脂糖(LMA)、正常熔點瓊脂糖(NMA)、肌氨酸鈉、Triton X-100二甲基亞砜(DMSO)及溴化已錠(EB)等均購自Amresco公司;其他試劑均為優(yōu)級分析純.

1.6 統(tǒng)計分析

熒光顯微鏡下用515~560 nm的激發(fā)光觀察,在X100下,每張涂片上隨機觀察5個視野,每個視野多于5個細胞,每組6張載玻片.用IMI1.0(深圳良正軟件開發(fā)有限公司)彗星分析軟件測定彗星長、尾長、尾部DNA百分數(shù)、彗星分布矩、尾慣量、Olive尾矩等指標,用EXCELL和SPSS軟件對所獲得數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗(1-Sample K-S)和單因數(shù)方差分析(One-Way ANOVA),結(jié)果以mean±SD表示.P<0.05表示運動組與對照組之間的差異顯著性.

2 結(jié)果

2.1 動物體重的變化

從表1可以看出,實驗前對照組和運動組小鼠體重末見明顯差異(P>0.05).實驗期間隨游泳天數(shù)的增加,對照組小鼠的體重自然增長速度略高于各運動組,但組間仍沒有顯著差異(P>0.05).

表1 小鼠體重的變化和運動時間

2.2 力竭運動后小鼠骨骼肌細胞DNA損傷的形態(tài)學觀察

染色后在熒光顯微鏡下觀察,陰性對照組骨骼肌細胞經(jīng)單細胞電泳絕大部分表現(xiàn)為一圓形熒光團,熒光強度均勻,邊緣光滑,即彗星頭部,無明顯拖尾現(xiàn)象(圖4,A);尤其在運動后即刻,不僅典型的彗星樣細胞的出現(xiàn)率明顯升高,彗星的尾巴加長,尾部的熒光強度增強,彗星頭部的直徑隨著尾部的加長而減小(圖4,B);隨著恢復(fù)時間的延長,運動后24 h,部分細胞出現(xiàn)"彗星尾",但較即刻組明顯降低(圖4,C);而在運動后48 h,骨骼肌細胞核卻無明顯拖尾,和對照組的形狀差不多(圖4,C、D).

圖4 力竭運動后小鼠骨骼肌細胞DNA損傷的形態(tài)學觀察

2.3 SCGE檢測心肌細胞在不同恢復(fù)期DNA損傷各指標變化趨勢

彗星圖像經(jīng)熒光分析軟件統(tǒng)計分析結(jié)果見表2,力竭運動后小鼠骨骼肌細胞在即刻和24 h的DNA損傷程度明顯高于對照組,表現(xiàn)為目前國際上廣泛采用的綜合指標彗星分布矩、Olive尾矩、尾慣量、尾分布矩的數(shù)據(jù)結(jié)果明顯高于對照組(P<0.01),其中尾分布矩和尾慣量被認為是計算機分析系統(tǒng)中較好的指標,二者均與DNA損傷的水平存在高度相關(guān)性,這是因為DNA損傷越嚴重,導致DNA超螺旋結(jié)構(gòu)越松散,產(chǎn)生的斷裂點越多,DNA片段越小,從彗星頭部跑到彗星尾部的DNA斷片越多,則彗星尾部的長度、面積和熒光強度越大.而力竭后48 h小鼠骨骼肌細胞的DNA損傷參數(shù)彗星長、尾長、尾%DNA、遷移率、Olive尾矩都略高于對照組,但這兩個時相之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),可見力竭后48 h DNA損傷基本恢復(fù).DNA受損而發(fā)生遷移的各個特征參數(shù)在力竭運動后不同恢復(fù)期的變化趨勢如表2.

表2 力竭運動后小鼠心肌細胞在不同恢復(fù)期的DNA損傷各指標變化趨勢

2.4 力竭運動后小鼠骨骼肌在不同恢復(fù)期氧化應(yīng)激水平的變化

從表3可知,力竭運動后即刻,小鼠骨骼肌組織SOD酶活性都較對照組有非常顯著升高(P<0.01),運動后24 h和48 h組與對照組相比也顯著升高(P<0.05),但較即刻組有下降的趨勢,而無統(tǒng)計學意義(P>0.05).小鼠骨骼肌組織GSH含量在力竭運動后即刻較對照組有顯著的下降(P<0.01),而運動后24 h和48 h組與對照組相比則無顯著差異(P>0.05),但與即刻組相比,GSH含量顯著升高(P<0.05).小鼠骨骼肌組織MDA含量在運動后即刻組和24 h組均較對照組顯著升高(P<0.01),其中即刻組也顯著高于24 h組(P<0.05),而48 h組與對照組相比則無顯著差異(P>0.05).

表3 力竭運動后小鼠骨骼肌在不同恢復(fù)期自由基代謝水平

3 討論與分析

在細胞的生存過程中,DNA會遭到內(nèi)源性和外源性的攻擊,DNA在損傷因素的作用下,主要產(chǎn)生堿基損傷和DNA鏈的斷裂,DNA損傷的主要生物效應(yīng)是細胞突變和死亡[4].它們的損傷和突變將會對生物體產(chǎn)生嚴重影響,導致一系列生理功能紊亂和組織病理學改變,甚至癌變[5].

自由基能和體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類等重要的大分子反應(yīng),損壞它們的功能,引起一系列的疾病,如癌癥、心血管疾病和衰老等.SCGE技術(shù)已成為一種檢測DNA損傷的常用技術(shù),可以相對定量地反映單個細胞內(nèi)DNA的損傷情況.在本實驗研究中,大強度反復(fù)力竭運動后用SCGE技術(shù)檢測到了運動后即刻和運動后24 h,DNA的損傷值顯著高于對照組,可見力竭運動對組織細胞的DNA損傷持續(xù)到運動后兩天,而在運動后即刻到48 h DNA損傷有降低的趨勢,但運動后48 h的DNA損傷仍顯著高于對照組.從表1可知彗星實驗所選指標都反映出力竭運動后即刻的DNA損傷顯著大于運動后24 h和48 h.力竭運動可導致機體自由基和脂質(zhì)過氧化水平增加已得到廣泛證實.一些研究報道發(fā)現(xiàn)運動性氧應(yīng)激與細胞DNA損傷有關(guān)[6].Forrest[7]等研究認為大強度運動后,隨著自由基的增多,細胞抗氧化能力降低,膜脂質(zhì)被過氧化后,進一步攻擊位于核小體之間的組蛋白成分,導致堿基修飾、堿基丟失、單鏈和雙鏈DNA的斷裂、DNA交鏈而造成DNA損傷,引起細胞凋亡,造成骨骼肌細胞的微損傷.SOD是需氧生物體數(shù)千種酶中底物為氧自由基的唯一酶,作用是歧化O-2生成H2O2,從而阻斷毒性更強的羥自由基產(chǎn)生[8].體內(nèi)GSH能自行或經(jīng)GSH-Px催化過氧化氫和過氧化脂質(zhì)的還原,消除自由基造成的損傷,是細胞抵抗活性氧損害的主要物質(zhì),GSH較敏感且能綜合反映組織細胞抗損傷能力及受損傷程度,GSH作為抗氧化劑,保護細胞膜的巰基蛋白和巰基酶不被氧化,并可與其他抗氧化劑協(xié)同作用[9].MDA含量的高低可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接地反映細胞受損程度.諸多研究證實,劇烈運動可促使體內(nèi)活性氧產(chǎn)生、脂質(zhì)過氧化增強及MDA水平升高而導致運動能力下降,產(chǎn)生運動性疲勞[10].本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),力竭運動后即刻、24 h和48 h的SOD水平都顯著高于安靜對照組,其中即刻組較安靜組最為顯著(P<0.01).運動后即刻組的GSH水平顯著低于對照組,而24 h組和48 h組與對照組相比無顯著差異(P>0.05).MDA水平在運動后即刻和24h都顯著高于對照組(P<0.01),其中運動后即刻MDA水平最為顯著,而運動后48hMDA水平與對照組無顯著差異(P>0.05).從表2可知運動后即刻SOD活性和MDA水平都較安靜對照組有顯著的升高(P<0.01),GSH水平較安靜對照組有顯著的降低(P<0.01),從表1可知運動后即刻DNA損傷程度最為顯著(P<0.01),由此可推論運動性氧應(yīng)激參與介導了組織細胞的DNA損傷,DNA損傷程度與氧化應(yīng)激水平呈正相關(guān),SOD活性急劇升高可能是機體運動過程中抗氧化能力代償性增加,以達到減少組織損害的結(jié)果.骨骼肌組織GSH水平在運動后24 h和48 h及48 h組MDA水平與對照組相比無顯著差異,而骨骼肌細胞的DNA損傷值在24 h和48 h仍顯著高于對照組,這與DNA損傷的修復(fù)程度有關(guān),可能是力竭運動后氧化應(yīng)激所致骨骼肌細胞的DNA損傷程度較高,因而其修復(fù)時間也滯后.

大強度力竭運動可致骨骼肌組織細胞的DNA損傷,其損傷程度在運動后即刻、24 h和48 h等時相有不同的時間效應(yīng),在運動后的即刻、24 h和48 h DNA損傷程度顯著高于對照組,隨著運動后時間的推移,DNA損傷程度有降低的趨勢,但到了運動后48 h,彗星各項指標仍顯著高于對照組(P<0.05),而氧化應(yīng)激水平SOD活性和MDA水平在運動后即刻都有顯著增加(P<0.01),GSH水平在運動后即刻有顯著降低(P<0.01).由此可見力竭運動所致的骨骼肌細胞DNA損傷與氧化應(yīng)激水平有密切的關(guān)系,運動性氧應(yīng)激參與介導了細胞DNA損傷,運動性氧應(yīng)激是組織細胞DNA損傷的機制之一,適時有效的抗氧化劑補充將有利于防護組織細胞DNA損傷.

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