武強(qiáng) ，李露斯 ，范文輝 ，黎紅華 ，濮捷 ，徐志鵬 ，程鶴 ，楊柳 ，劉菲 ，廖光昊

pEGFP/A2M(FP6)轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞海馬移植治療APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的實(shí)驗(yàn)觀察

武強(qiáng)1，李露斯2，范文輝2，黎紅華1，濮捷1，徐志鵬1，程鶴1，楊柳1，劉菲1，廖光昊1

目的：攜帶pEGFP/A2M(FP6)的神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）定向移植到APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬內(nèi)，觀察移植細(xì)胞的分化、遷移，腦內(nèi)Aβ沉積的變化，以及對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。方法：APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠分為假手術(shù)（SO）組、人工腦脊液（ACSF）組、轉(zhuǎn)染pEGFP的NSCs（pEGFP-NSCs）組及轉(zhuǎn)染pEGFP/A2M(FP6)的NSCs（pEGFP/A2M(FP6)-NSCs）組，移植物小鼠海馬CA1區(qū)定位注射，水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠認(rèn)知功能，免疫組化觀察小鼠腦內(nèi)移植細(xì)胞的分化、遷移及Aβ病理變化。結(jié)果：pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組和pEGFP-NSCs組轉(zhuǎn)基因小鼠逃避潛伏期較SO組及ACSF組顯著縮短（P＜0.05）；pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組轉(zhuǎn)基因小鼠逃避潛伏期較pEGFP-NSCs組縮短（P＜0.05）。pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組和pEGFP-NSCs組轉(zhuǎn)基因小鼠海馬及皮質(zhì)內(nèi)，部分Aβ染色陽性斑塊周圍可見表達(dá)EGFP的移植細(xì)胞。pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組轉(zhuǎn)基因小鼠額葉、海馬區(qū)域，Aβ染色陽性斑塊數(shù)量和平均面積均較其他3組顯著減少（P＜0.05）。移植的NSCs，部分細(xì)胞Nestin染色呈陽性，部分細(xì)胞GFAP染色呈陽性，少數(shù)細(xì)胞MAP-2染色呈陽性。結(jié)論：移植pEGFP/A2M(FP6)NSCs到APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬，可減少AD小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊沉積，部分移植的NSCs分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞，小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能顯著改善。

神經(jīng)干細(xì)胞；pEGFP/A2M(FP6)；APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠

fanwenhui@gmail.com

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是發(fā)生于老年和老年前期以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損壞為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。本課題組前期已成功將攜帶α2巨球蛋白（alpha-2macroglobulin,A2M）cDNA片段[A2M(FP6)]-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（pEGFP）重組質(zhì)粒[pEGFP/A2M(FP6)]轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells,NSCs），在體外多次傳代不影響目的基因的表達(dá)及NSCs的分化[2]。研究顯示，pEGFP/A2M(FP6)的轉(zhuǎn)染能明顯提高體外培養(yǎng)的NSCs體系對β淀粉蛋白（amyloidβ,Aβ）毒性的耐受性[3]。本研究擬觀察攜帶pEGFP/A2M(FP6)的NSCs腦內(nèi)移植后，能否減少Aβ斑塊的沉積并改善AD小鼠的認(rèn)知功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 B6C3-Tg(APPswe,PSEN1de9)85Dbo/J品系雙轉(zhuǎn)基因小鼠雜合體種鼠購于Jackson動物中心。繁殖后得到APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠32只，非轉(zhuǎn)基因小鼠32只，均為11～12月齡，分籠喂養(yǎng)于光照/黑暗為12 h/12 h的恒溫環(huán)境，2只/籠，自由攝食和飲水。

1.1.2 主要試劑與材料 山羊抗小鼠Nestin一抗、兔抗小鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein,GFAP）一抗購于Santa Cruz公司；小鼠抗小鼠微管相關(guān)蛋白 -2（microtubule associated protein-2,MAP-2）一抗購于Chemicon公司；小鼠抗人Aβ一抗購于Sigma公司。異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠及兔抗山羊二抗、羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠、兔抗山羊及山羊抗兔二抗均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。江灣I型動物腦立體定位儀購于上海奧爾科特生物科技有限公司，Leica冰凍切片機(jī)購于Leica公司，熒光顯微鏡（OLYMPUS IX70）購于OLYMPUS公司，Morris水迷宮DMS-2系統(tǒng)由中國科學(xué)院藥物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 分組及海馬移植 實(shí)驗(yàn)小鼠分為4組（每組含APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠各8只）：①假手術(shù)（sham operated,SO）組：僅進(jìn)行動物麻醉、手術(shù)鉆孔后縫合頭皮；②人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid,ACSF）組：海馬移植ACSF 5 μL；③轉(zhuǎn)染 pEGFP的 NSCs（pEGFP-NSCs）組：海馬細(xì)胞移植轉(zhuǎn)染pEGFP的NSCs 2×105個，溶于 5μLACSF；④轉(zhuǎn)染 pEGFP/A2M(FP6)的 NSCs（pEGFP/A2M(FP6)-NSCs）組：海馬移植轉(zhuǎn)染pEGFP/A2M(FP6)的NSCs 2×105個，溶于 5μL ACSF。海馬CA1區(qū)移植：麻醉小鼠后固定于腦立體定位儀；于前囟后2.3mm，矢狀縫右側(cè)旁開2.0mm，常規(guī)鉆孔，微量注射器抽吸5μL移植物，硬腦膜下進(jìn)針1.8mm；注射速度1μL/m in，注射完留針 15m in，緩慢退針；術(shù)后預(yù)防感染。

1.2.2 學(xué)習(xí)記憶功能測定 術(shù)后 53～59 d進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)（隱蔽平臺獲得實(shí)驗(yàn)+空間搜索實(shí)驗(yàn)）測定各組小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。在隱蔽平臺獲得實(shí)驗(yàn)中，測量小鼠的逃避潛伏期，用于檢測學(xué)習(xí)和記憶能力；在空間搜索實(shí)驗(yàn)中，測量在規(guī)定時間內(nèi)小鼠在目標(biāo)象限的百分比，用于測量記憶保持能力。

1.2.3 小鼠腦內(nèi)移植物的免疫組織化學(xué)鑒定 術(shù)后60 d，處死小鼠，灌注取腦，切片厚度35μm，將包含海馬注射位點(diǎn)的所有切片按順序收集于盛有抗凍緩沖液的12孔培養(yǎng)板中，每隔5張切片取1張切片，每只小鼠可得5套部位相同或相近、每套包含海馬和齒狀回的12張切片。采用漂片法免疫熒光組織化學(xué)染色檢測Nestin、GFAP及MAP-2的表達(dá)，抗體稀釋比例均為1:100，熒光顯微鏡觀察攝片。數(shù)碼圖像應(yīng)用Image-Pro plus6.0圖像分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。

1.2.4 小鼠腦組織的Aβ免疫組織化學(xué)分析 取包含海馬注射位點(diǎn)的連續(xù)5張切片，采用漂片法免疫熒光組織化學(xué)染色檢測Aβ的表達(dá)。小鼠抗人Aβ抗體稀釋比例1:1 000，羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗稀釋比例為1:50，熒光顯微鏡觀察攝片。數(shù)碼圖像應(yīng)用Image-Pro plus6.0圖像分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 10.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用雙因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮測試結(jié)果

2.1.1 隱蔽平臺獲得實(shí)驗(yàn) 各組平均逃避潛伏期隨訓(xùn)練時間延長均明顯縮短，提示各組小鼠均有學(xué)習(xí)記憶的能力。比較各組雙轉(zhuǎn)基因小鼠第4、5、6天的平均逃避潛伏期 ，pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組 及pEGFP-NSCs組明顯較SO組及ACSF組縮短（P＜0.05），以 pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組尤為明顯，且pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組較pEGFP-NSCs組縮短（P＜0.05），見圖1A。各組非轉(zhuǎn)基因小鼠的平均逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1B。

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn) pEGFP-NSCs組和pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠在目標(biāo)象限搜索時間的百分比較SO及ACSF組有所增加，以pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組更明顯，但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

2.2 各組小鼠腦內(nèi)移植物的免疫組織化學(xué)鑒定

ACSF組和SO組小鼠腦內(nèi)未見表達(dá)EGFP的細(xì)胞，而pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組和pEGFP-NSCs組小鼠腦內(nèi)可見表達(dá)EGFP的細(xì)胞，大多分布在針道附近，發(fā)出亮綠色熒光，部分細(xì)胞向深部遷移，見圖3A，部分遷移到同側(cè)大腦皮質(zhì)，亦有部分細(xì)胞沿著胼胝體向?qū)?cè)大腦遷移；部分EGFP陽性細(xì)胞分布在Aβ斑塊周圍，見圖3B。移植的部分細(xì)胞Nestin染色呈陽性，見圖3C；部分細(xì)胞GFAP染色呈陽性，少量細(xì)胞MAP-2染色呈陽性，見圖3D。

2.3 各組小鼠腦組織的Aβ免疫組織化學(xué)分析

各組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠注射側(cè)相同部位的額葉皮質(zhì)及海馬區(qū)Aβ免疫熒光結(jié)果顯示，pEGFP-NSCs組及ACSF組小鼠額葉皮質(zhì)及海馬區(qū)Aβ斑塊數(shù)量及平均面積與SO組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但3組Aβ斑塊數(shù)量及平均面積均顯著高于 pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組（P<0.01），見表 1，圖 4。

3 討論

圖3 pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組小鼠腦內(nèi)移植物的免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果（熒光顯微鏡，×200）

表1 各組小鼠額葉皮質(zhì)、海馬Aβ斑塊數(shù)量及平均面積

A2M是Aβ的一種高親和力的結(jié)合蛋白，其C末端的27個氨基酸可與Aβ肽特異性結(jié)合來中和Aβ的毒性，降解并清除Aβ。通過不同的限制性內(nèi)切酶消化及PCR技術(shù)可將A2M分為FP1～6共6個片段，Aβ與FP6段選擇性結(jié)合，且具有高度特異性[4]，提示A2M(FP6)可能成為一個治療AD的新方向。前期本課題組已將pEGFP/A2M(FP6)重組質(zhì)粒利用Nucleofector轉(zhuǎn)染技術(shù)成功轉(zhuǎn)染進(jìn) NSCs，轉(zhuǎn)染了 pEGFP/A2M(FP6)的NSCs在體外經(jīng)多次傳代后仍可表達(dá)A2M(FP6)mRNA及A2M蛋白，NSCs本身仍能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[2]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，移植轉(zhuǎn)染pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬及皮質(zhì)內(nèi)，Aβ斑塊數(shù)量及平均面積均明顯減少。結(jié)合本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[2]，筆者推測轉(zhuǎn)染了pEGFP/A2M(FP6)的NSCs在體內(nèi)也具有合成A2M(FP6)蛋白的功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，部分移植的EGFP陽性細(xì)胞包繞Aβ斑塊，包含EGFP陽性的移植細(xì)胞因同時包含有A2M(FP6)，推斷移植的細(xì)胞可能將A2M(FP6)，定向輸送到病變的Aβ斑塊周圍，從而清除Aβ。

本實(shí)驗(yàn)水迷宮測試結(jié)果顯示，海馬移植pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組及pEGFP-NSCs組均能顯著改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，其中以pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組更為顯著。而在空間探索實(shí)驗(yàn)中，各組的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠在目標(biāo)象限停留時間比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但pEGFP-NSCs組和pEGFPA2M(FP6)-NSCs組的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠在目標(biāo)象限搜索時間的百分比有所增加，以pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組更為明顯。雖無統(tǒng)計學(xué)意義，但可能說明海馬移植轉(zhuǎn)染pEGFP/A2M(FP6)NSCs對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的空間記憶保持能力較其它組小鼠改善更明顯。從水迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以得出，轉(zhuǎn)染pEGFP/A2M(FP6)的NSCs海馬移植后，可以顯著地改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。推斷其原因，可能由于轉(zhuǎn)染pEGFP/A2M(FP6)的NSCs可以減少皮質(zhì)及海馬區(qū)Aβ斑塊的沉積，從而改善了小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。本研究還顯示，pEGFP-NSCs組中AD小鼠在水迷宮測試中，其逃避潛伏期較對照組明顯縮短，但小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊并無明顯變化。推測可能是由于pEGFPNSCs組沒有針對Aβ環(huán)節(jié)的治療措施，移植后小鼠的Aβ斑塊沒有變化。但可能移植后的NSCs在局部微環(huán)境的作用下，分化成為膽堿能神經(jīng)元和其他神經(jīng)支持細(xì)胞，提高了AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[5]。

實(shí)驗(yàn)中筆者觀察到移植后的NSCs可向同側(cè)皮質(zhì)遷移，也可沿胼胝體向?qū)?cè)大腦遷移，而且部分EGFP陽性細(xì)胞遷移后可包繞Aβ斑塊，移植的NSCs多數(shù)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，少量分化為神經(jīng)元。這也與大多數(shù)學(xué)者的研究一致，且研究顯示，NSCs遷移分化的機(jī)理可能與所處的微環(huán)境密切相關(guān)，局部環(huán)境而不是NSCs自身的內(nèi)在特性決定了移植細(xì)胞的最終命運(yùn)[6,7]。Kim等[9]研究認(rèn)為，在成年腦組織中，NSCs必須遷移到靶區(qū)域才能表現(xiàn)出它們的神經(jīng)可塑性。另外，NSCs是未分化的原始細(xì)胞，具有低免疫源性，移植后相對較少發(fā)生異體排斥反應(yīng)，有利于其存活[10]。Tate等[11]的研究顯示，移植后的NSCs能被特異性吸引到腦內(nèi)神經(jīng)退行性變區(qū)域，即NSCs具有Aβ?lián)p傷區(qū)的自主追蹤性，可以在治療AD等全腦神經(jīng)退行性病變中起傳遞治療性分子的作用，然而目前尚不清楚刺激NSCs遷移的信號為Aβ本身還是Aβ造成的損傷區(qū)釋放的炎癥分子。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，轉(zhuǎn)染pEGFP/A2M(FP6)-NSCs海馬移植可以減少APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠額葉皮質(zhì)及海馬區(qū)的Aβ斑塊沉積，并能改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，但其作用機(jī)制仍有待作進(jìn)一步的研究。如何誘導(dǎo)NSCs向修復(fù)所需的神經(jīng)功能（目的）細(xì)胞分化，誘導(dǎo)NSCs在病變部位定向分化為膽堿能神經(jīng)元，建立功能連接，優(yōu)化用于對NSCs進(jìn)行修飾的基因或藥物等問題還需要進(jìn)一步的探索。

圖4 SO組及pEGFP/A2M(FP6)-NSCs組雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠額葉皮質(zhì)及海馬區(qū)Aβ斑塊免疫熒光染色結(jié)果（熒光顯微鏡，×200）

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Treatment of APP/PS1 Double Transgenic mice of Alzheimer’s Disease by Transplanting pEGFP/A2M

(FP6)Transfected Neural Stem Cells into the Hippocampus

WU Qiang▲,LILu-si,FAN Wen-hui,LI Hong-hua,PU Jie,XU Zhi-peng,CHENG He,YANG Liu,LIU Fei,LIAO Guang-hao.▲Department ofNeurology,GeneralHospitalofGuangzhou PLA,Wuhan 430070,China

Objective:To observe themigration and differentiation of pEGFP/A2M(FP6)transfected neural stem cells(NSCs),the depositsof Aβin the brain and the change of learning andmemory ability of APP/PS1 double transgenicmice of Alzheimer’s Disease(AD)after the NSCswere transplanted into the hippocampus.Methods:APP/PS1 transgenic ADmicewere random ly divided intofour groups:sham operated(SO)group,artificial cerebrospinal fluid(ACSF)group,transfected pEGFP neural stem cell(pEGFP-NSCs)group and transfected pEGFP/A2M(FP6)neural stem cell(pEGFP/A2M(FP6)-NSCs)group.The ACSF,pEGFP-NSCs or pEGFP/A2M(FP6)-NSCswere transplanted into the CA1 region of the hippocampusof themice.The learning andmemory ability of themicewereassessedwith M irrorwatermaze test.Themigration and differentiation of pEGFP/A2M(FP6)transfected NSCsand the depositsof Aβin thebrain of themicewereobserved by immunohistochem istry.Results:The latenciesof pEGFP/A2M(FP6)-NSCsgroup and pEGFP-NSCsgroup were significantly shorter than that in the SO group and ASCF group(P<0.05).The latency of pEGFP/A2M(FP6)-NSCs groupwasshorter than that in the pEGFP-NSCsgroup(P<0.05).Anti-Aβdetection showed Aβdeposits in the hippocampusand cortex of pEGFP/A2M(FP6)-NSCsgroup and pEGFP-NSCsgroup were surrounded by transplanted NSCs.The amount and average size of Aβdeposits in the hippocampus and cortex of pEGFP/A2M(FP6)-NSCs group were reducedmarkedly,compared with the other three groups(P<0.05).The expression of Nestin was detecte after transplantation.Immunofluorescent detection indicated thatmajority of transplanted cells expressed GFAPwhile only a few cells expressed MAP-2.Conclusion:Transplantation of pEGFP/A2M(FP6)-NSCs into the hippocampal region of APP/PS1 double transgenic ADmice could reduce the Aβdeposits and promote the learning andmemory ability.Partial transplanted NSCsw illdifferentiate into neuronsorastrocytes.

neuralstem cells;pEGFP/A2M(FP6);APP/PS1 double transgenicmice

R741；R741.05

A

1001-117X（2013）02-0103-06

1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 武漢430070

2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 重慶400038

收稿目期2012-09 -06

范文輝