蔣麗娟，尹 穎＊＊，楊柳燕，尹大強(qiáng)，王曉蓉，郭紅巖

(1:南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210046)

(2:同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，長江水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200092)

藻類是水體中的主要初級生產(chǎn)者，也是水生食物鏈的基礎(chǔ)環(huán)節(jié).它們的存在無論是對水體生產(chǎn)力還是水體污染的自凈作用均具有十分重要的意義.因此，在研究毒物或廢水對水環(huán)境的影響時，都把藻類測試作為一項(xiàng)重要內(nèi)容.斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)在分類上隸屬綠藻門的柵藻科，是常見的浮游藻類.在國內(nèi)，斜生柵藻和小球藻最常用于毒性測試.以前以重金屬為目標(biāo)污染物的研究較多［1］，近年來主要研究有機(jī)污染物對藻類的毒性效應(yīng)［2-3］，而關(guān)于污染物對藻類產(chǎn)生的影響的研究大多集中于光合色素、蛋白質(zhì)含量、藻的生長和半效應(yīng)抑制濃度等生理指標(biāo)，以及污染物長期暴露導(dǎo)致的藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)和群落形態(tài)的變化等方面.污染物對藻產(chǎn)生生物效應(yīng)的機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究.自由基被醫(yī)學(xué)上認(rèn)為是萬病之源，其對機(jī)體產(chǎn)生的毒性效應(yīng)目前已經(jīng)得到大量的證實(shí)［4-5］，而藻類在污染物作用下是否也產(chǎn)生自由基的累積，還鮮有文獻(xiàn)報道.

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類典型持久性有機(jī)污染物，因其“三致”效應(yīng)受到廣泛關(guān)注.目前，在各種環(huán)境介質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)了多環(huán)芳烴，菲是多環(huán)芳烴中含量較高的化合物，在各類已檢測出多環(huán)芳烴的樣品中幾乎都含有菲;研究表明，PAHs等有機(jī)污染物在生物體內(nèi)代謝時會產(chǎn)生自由基，進(jìn)而引起各種抗氧化系統(tǒng)酶活性的變化［6］，但其對藻類產(chǎn)生自由基誘導(dǎo)及脅迫作用的研究報道不多.本文以斜生柵藻為材料，研究了不同濃度的菲靜態(tài)暴露96 h后，對柵藻的生長、自由基的產(chǎn)生、各項(xiàng)抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)的響應(yīng)以及它們之間的相互關(guān)聯(lián)，為菲污染對水生生態(tài)環(huán)境的影響研究提供更多的理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 供試材料

儀器:主要有Bruker EMK10/12型電子順磁共振譜儀、島津RF-5000型熒光分光光度計、J2-HS高速冷凍離心機(jī)、UV1600紫外可見分光光度計、Labconco冷凍干燥器、DK-S24恒溫水浴鍋、PIX生化恒溫多用培養(yǎng)箱.

試劑:菲(純度99%)、2-硫代巴比妥酸，牛血清蛋白購自Sigma公司，均采用分析純以上試劑.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)由中國科學(xué)院水生生物研究所提供.將藻種接種至MA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng).培養(yǎng)條件:溫度25℃ ±0.5℃，pH 7～8，光暗比12 h∶12 h，光強(qiáng)3000 lx，靜置培養(yǎng)，每天定時人工搖動3次.藻進(jìn)入對數(shù)生長期(105cells/ml)，設(shè)置5個菲濃度組(0.005、0.01、0.025、0.05、0.1 mg/L)和對照組，每組設(shè)8 個平行.96 h 后取樣檢測.

1.3 分析測定方法

1.3.1 生長抑制 采用顯微鏡下血球計數(shù)板計數(shù)，在波長687 nm下測定斜生柵藻吸光度，建立藻細(xì)胞濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線.根據(jù)96 h暴露后藻液的吸光度計算藻細(xì)胞的濃度.將藻液4500轉(zhuǎn)/min離心15 min后收集藻細(xì)胞.

1.3.2 自由基的測定 藻細(xì)胞冷凍干燥，稱量0.01 g，裝入內(nèi)徑為3 mm的石英管中進(jìn)行ESR分析，操作過程中避免水分沾入.ESR的操作參數(shù):測試溫度為室溫，微波功率(SP)為20 mW，微波頻率(SF)為X-band，調(diào)制頻率(MF)為 100 kHz，調(diào)制幅度(MA)為 1.0 Gs，中心磁場(CF)為 3470 Gs，掃描時間(TI)為 84 s，時間常數(shù)(TC)為 41 ms，掃場寬度(SW)為 200 Gs，信號 2 次疊加［7］.

1.3.3 抗氧化酶活性的測定 粗酶提取液:取一定量藻細(xì)胞，加入2 ml Tris-硼酸緩沖液(0.01 mol/L Tris，0.05 mol/L H3BO4，0.05 mol/L EDTA，1 μl 95% 巰基乙醇)，冰浴中抽提 10 min，4℃ 離心(10000 轉(zhuǎn)/min)20 min，取上清液待測.

超氧化物歧化酶(SOD)用氮藍(lán)四唑法［8］測定.過氧化物酶(POD)用鄰苯三酚法［9］測定.谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的測定采用Habig法［10］.

1.3.4 谷胱甘肽含量的測定 采用熒光分光光度法，參照Hissin等［11］的方法，將液氮固定的鮮樣，加入一定量的0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(0.005 mol/L EDTA，pH=8.0)和 25%HPO3，冰浴上充分研磨，冷凍離心(4℃，13000 轉(zhuǎn)/min，15 min)，上清液冷藏待測.

還原型谷胱甘肽(GSH)含量測定:取100 μl組織液，加入2.8 ml 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH=8.0)及100 μl(1 mg/ml)熒光試劑鄰苯二甲醛(OPT)，混勻，室溫放置10 min后以343 nm為激發(fā)光，在425 nm處測定熒光強(qiáng)度.

氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量測定:取500 μl組織液與200 μl 0.04 mol/L N-乙酰順丁烯二酰亞胺(NEMI)溶液混勻，室溫放置 20 min 后，取 100 μl加入 2.8 ml 0.1 mol/L NaOH 及 100 μl(1 mg/ml)OPT 熒光試劑，充分混合，之后同上.

酶的活性和谷胱甘肽含量均用蛋白標(biāo)定.蛋白質(zhì)含量用色素結(jié)合法測定［12］，以小牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

1.3.5 脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量的測定 采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法［13］，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)以每毫克蛋白中含硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(TBARS)的量(nmol/ml)表示，摩爾消光系數(shù)e=1.56 ×105mol/(ml·cm).

1.4 統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差.使用SPSS統(tǒng)計軟件和單邊ANOVA法對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性顯著分析，P＜0.05表明差異顯著.Origin 7.0統(tǒng)計軟件處理自由基數(shù)據(jù).

2 結(jié)果

2.1 菲對斜生柵藻生長的影響

經(jīng)過96 h暴露后，斜生柵藻的生長量隨菲濃度的增高而降低，當(dāng)菲濃度為0.005 mg/L時，藻細(xì)胞的生長開始受到抑制，隨著菲暴露濃度的升高(≥0.01 mg/L)，藻細(xì)胞的生長受到顯著抑制.菲的暴露濃度繼續(xù)增大至0.025 mg/L時，藻細(xì)胞的生長變化較小(圖1).

圖1 菲對斜生柵藻生長效應(yīng)的影響Fig.1 Effect of phenanthrene on the growth of S.obliquus

2.2 菲誘導(dǎo)斜生柵藻產(chǎn)生自由基

用電子自旋共振(EPR)直接測得菲誘導(dǎo)下斜生柵藻細(xì)胞中自由基的產(chǎn)生(圖2)，EPR譜圖在3468～3478 mT寬度內(nèi)有較強(qiáng)的信號，經(jīng)計算機(jī)擬合分析，根據(jù)公式h·v=g·β·B(h為自旋電子角動量，v為電子共振頻率，β為電子的波爾磁子，B為中心磁場強(qiáng)度，g光譜分裂因子)，g=2.0033，幅寬為 10.15 mT，為一單峰.暴露濃度為0.01 mg/L時，菲誘導(dǎo)斜生柵藻產(chǎn)生的自由基信號強(qiáng)度與對照組相比有顯著差異(P＜0.05).在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的暴露濃度中，暴露組樣品產(chǎn)生的自由基信號均比空白強(qiáng)(圖3)，說明斜生柵藻在菲的脅迫下誘導(dǎo)產(chǎn)生了自由基.

圖2 菲暴露下斜生柵藻產(chǎn)生的EPR圖譜Fig.2 EPR spectra of free radicals in S.obliquus exposed to phenanthrene

圖3 自由基信號強(qiáng)度與菲暴露的劑量效應(yīng)關(guān)系Fig.3 Dose-effect relationship between free radical signal intensity and phenanthrene contents

2.3 菲對斜生柵藻抗氧化酶活性的影響

菲暴露下，斜生柵藻SOD、POD、GST活性與對照組相比均被誘導(dǎo)，SOD活性在低濃度暴露時沒有出現(xiàn)顯著性差異，當(dāng)菲的暴露濃度達(dá)到0.05 mg/L時，SOD活性出現(xiàn)顯著誘導(dǎo)(P＜0.05)，0.1 mg/L菲暴露組 SOD 活性達(dá)到對照組的2.03倍;0.005 mg/L菲暴露組POD活性與對照組相比沒有變化，隨著暴露濃度的增高，POD活性顯著增強(qiáng)，0.01 mg/L菲暴露組的酶活最強(qiáng)，菲暴露濃度繼續(xù)升高，POD活性則有下降的趨勢;GST活性在0.005 mg/L菲暴露時顯著誘導(dǎo)，隨著暴露濃度的增高，GST的活性輕微下降后又逐漸增強(qiáng)，0.05 mg/L暴露組的酶活最強(qiáng)，高濃度的兩組酶活變化較小(圖4).

圖4 菲對斜生柵藻抗氧化酶活性的影響Fig.4 Antioxidant defense enzyme activity in S.obliquus under phenanthrene exposure

2.4 菲對斜生柵藻谷胱甘肽含量的影響

菲暴露對斜生柵藻GSH、GSSG的影響表明，GSH隨菲暴露濃度變化趨勢與SOD活性變化相似，菲的暴露誘導(dǎo)GSH含量升高，這種誘導(dǎo)作用在0.1 mg/L暴露組最顯著，為對照組的2.15倍;GSSG含量在低濃度菲暴露(≤0.01 mg/L)時輕微降低，與對照組沒有顯著性差異，在高濃度菲暴露時(≥0.025 mg/L)，GSSG含量顯著升高，并在濃度達(dá)到0.1 mg/L時有下降趨勢，但與對照組相比還是顯著升高的(圖5).谷胱甘肽總量變化與GSSG變化相似，低濃度組與對照組沒有差異，高濃度組顯著升高.

圖5 菲對斜生柵藻GSH和GSSG的影響Fig.5 GSH and GSSG contents in S.obliquus under phenanthrene exposure

2.5 菲對斜生柵藻MDA含量的影響

菲誘導(dǎo)對斜生柵藻MDA含量的影響表明，各暴露組均誘導(dǎo)MDA含量升高，隨著菲濃度增大，MDA含量也隨之增大，暴露濃度≥0.025 mg/L時與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05)，暴露濃度為0.1 mg/L時，MDA含量最高，為對照組的1.85倍(圖6).

圖6 菲暴露對斜生柵藻MDA含量的影響Fig.6 MDA content in S.obliquus under phenanthrene exposure

3 討論

水體中的污染物對藻類生長產(chǎn)生脅迫作用，這種脅迫作用的程度直觀地反映在對藻細(xì)胞生長的促進(jìn)或抑制作用上.低濃度污染物對藻類產(chǎn)生刺激作用是一種普遍現(xiàn)象，Stebbing稱之為“毒物的興奮效應(yīng)”或“毒物刺激作用”［14］，例如，丙體“六六六”濃度小于0.2 mg/L時對斜生柵藻生長有促進(jìn)作用，在0.2 mg/L時則表現(xiàn)為抑制作用［15］.趙云英［16］的研究表明，當(dāng)藻類暴露于PAHs時，一般會導(dǎo)致葉綠素濃度的迅速下降、細(xì)胞和無機(jī)組分發(fā)生變化，影響細(xì)胞分裂速度，造成細(xì)胞密度的改變.在本研究中，菲的暴露已經(jīng)造成藻細(xì)胞密度的降低，可能是在實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的暴露濃度中，菲對斜生柵藻的暴露濃度已經(jīng)超過毒物刺激作用的濃度，對藻的生長產(chǎn)生了抑制作用.

有研究認(rèn)為，水生生物在分解多環(huán)芳烴時會產(chǎn)生大量的自由基中間產(chǎn)物［17］，這些中間產(chǎn)物可與核酸、蛋白質(zhì)等共價聯(lián)結(jié)，產(chǎn)生毒性作用，使細(xì)胞DNA受到損傷，引起畸變、死亡，近年來的許多研究結(jié)果支持這一觀點(diǎn).PAHs進(jìn)入生物體，與芳烴接受體(AhR)和細(xì)胞色素P450結(jié)合，導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生［18］，這些自由基可以攻擊細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)和生物膜系統(tǒng)，可以使葉綠體膜斷裂，基質(zhì)外漏，造成代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞變異或機(jī)體死亡.EPR測定自由基的技術(shù)日趨成熟，研究表明，自由基的產(chǎn)生對污染物比較敏感，可作為潛在的生物標(biāo)志物［19］.本實(shí)驗(yàn)中EPR測得的自由基，根據(jù)其特征該g因子的自由基可能是半醌類自由基或者多環(huán)芳烴自由基［20］，兩者皆為多環(huán)芳烴代謝過程中的產(chǎn)物.這種EPR直接測得的自由基信號較直觀地反映了藻類產(chǎn)生的主要自由基的量，隨著暴露濃度的升高，自由基的量明顯增加，進(jìn)一步說明產(chǎn)生自由基是多環(huán)芳烴代謝并對藻產(chǎn)生毒性的過程.自由基產(chǎn)生會引起抗氧化系統(tǒng)的相應(yīng)變化，通過酶促和非酶促保護(hù)系統(tǒng)使自由基的產(chǎn)生和消除維持動態(tài)平衡.SOD、POD和GST酶是生物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，能清除逆境脅迫所誘導(dǎo)產(chǎn)生的過多自由基，保護(hù)細(xì)胞免受傷害［21］，其活性的應(yīng)激性變化被廣泛作為反映生物受逆境脅迫程度的重要指標(biāo).菲暴露導(dǎo)致生物體逆境脅迫，產(chǎn)生大量自由基，SOD、POD活性在菲暴露濃度范圍內(nèi)被誘導(dǎo)增強(qiáng)，對自由基清除發(fā)揮了較大的作用.

作為生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要成分之一，GSH可以直接與生物體內(nèi)的自由基及親電化合物結(jié)合起解毒作用，在生物體內(nèi)的解毒代謝中起著重要的作用.在氧化狀態(tài)下，GSH一方面被氧化成GSSG，表現(xiàn)為相應(yīng)GSH/GSSG的降低;另一方面，GSH與外源毒物及其代謝物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，最終生成硫醇脲酸排出，此時僅為相應(yīng)GSH下降，而GSSG變化可能并不大，或者因GSH消耗而GSSG也降低［6］.在本實(shí)驗(yàn)中，GSH含量處于由于菲暴露而產(chǎn)生的適應(yīng)性誘導(dǎo)反應(yīng)，GSH含量升高的同時也誘導(dǎo)GST活性增強(qiáng)，并且在高濃度菲暴露時使得GSSG含量也升高.高含量的GSSG又可以通過還原反應(yīng)生成GSH，更好地在生物體內(nèi)起到自由基清除劑的作用.Oost等［22］經(jīng)過大量調(diào)查研究證實(shí)生物體GSH、GSH/GSSG比值對污染相當(dāng)敏感，可以考慮作為污染的生物檢測指標(biāo).本實(shí)驗(yàn)中，GSH和GSH/GSSG比值在0.025 mg/L菲暴露時產(chǎn)生顯著差異，并不比其他指標(biāo)更敏感.

菲暴露下斜生柵藻產(chǎn)生自由基，在抗氧化系統(tǒng)酶和非酶類抗氧化劑的共同作用下，自由基得到一定的緩解清除，但是自由基含量過高或者生成速度大于清除速度時，就會對機(jī)體造成不同程度的傷害，膜脂過氧化也是傷害之一，MDA在細(xì)胞內(nèi)的累積量通常被用來作為膜脂過氧化程度的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)中，隨著暴露濃度的增加MDA含量隨之增加，說明藻細(xì)胞受到氧化脅迫，同時MDA本身也會加劇藻細(xì)胞的傷害，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和催化功能發(fā)生變化并且抑制蛋白質(zhì)的合成，使細(xì)胞遭受逆境傷害.

近年來大量的研究在探討自由基及抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)是否可用作生物標(biāo)志物，從而對污染物的暴露和毒性效應(yīng)進(jìn)行早期預(yù)警［23-24］.研究發(fā)現(xiàn)抗氧化系統(tǒng)酶及非酶類抗氧化劑對環(huán)境中的污染物的確比較敏感，在低濃度即已表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)或抑制作用，與其他指標(biāo)相比，GST酶更敏感，這與本研究類似，在低濃度菲暴露時(0.005 mg/L)，GST酶即已顯著誘導(dǎo).但是，一般認(rèn)為較為敏感的GSH等指標(biāo)，在菲對斜生柵藻的暴露中并不比其他指標(biāo)更敏感.尹穎等［25］在研究多環(huán)芳烴對沉水植物的損傷時發(fā)現(xiàn)GSH/GSSG指標(biāo)不僅在低濃度暴露時顯著抑制，而且隨著暴露濃度的增加線性降低，但對藻類的影響并不如此.因此，在考慮將抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)作為敏感生物標(biāo)志物時，應(yīng)考慮生物種以及實(shí)際生態(tài)環(huán)境的差異.

綜上所述，自由基和抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)雖然被認(rèn)為在分子水平上反映生物體的脅迫效應(yīng)，但是在斜生柵藻對菲暴露的生物應(yīng)激反應(yīng)中并不比生長指標(biāo)更敏感，與其它水生生物不同，斜生柵藻的毒性損傷更直觀地反映在細(xì)胞生長密度上.EPR直接檢測自由基雖然不能像自旋捕獲技術(shù)那樣給自由基定性，但是它既能根據(jù)參數(shù)確定自由基的大概種類，又能反映藻細(xì)胞內(nèi)自由基的總量，進(jìn)一步推斷藻細(xì)胞受損傷的程度.

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