張 靜 ，韋玉春＊＊，王國祥，楊 飛 ，程春梅，夏曉瑞

(1:南京師范大學(xué)虛擬地理環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，南京210046)

(2:江蘇省環(huán)境演變與生態(tài)建設(shè)重點(diǎn)實(shí)驗室，南京210046)

藍(lán)藻是一類極其古老、微小的原核生物，具有極強(qiáng)的生態(tài)競爭優(yōu)勢.伴隨著富營養(yǎng)化，藍(lán)藻會大量生長與繁殖，形成水華，給水體水質(zhì)帶來嚴(yán)重的危害［1］.藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，PC)在620 nm附近有一個吸收峰，是藍(lán)藻的特征色素蛋白之一［2］.在環(huán)境監(jiān)測中，特別是在藍(lán)藻水華頻發(fā)的水域，藻藍(lán)蛋白濃度能有效地表征藍(lán)藻生物量.準(zhǔn)確提取水體中的藻藍(lán)蛋白，對藻藍(lán)蛋白濃度定量、藍(lán)藻水華監(jiān)測具有重要意義.

目前，實(shí)驗使用的藻藍(lán)蛋白的提取方法較多，常用的有反復(fù)凍融法、化學(xué)試劑處理法、溶脹法、超聲波法等［3-21］.典型研究如Padgett等［4］使用反復(fù)凍融法提取了銅綠微囊藻中的藻藍(lán)蛋白;曲文娟等［14］采用脈沖超聲輔助技術(shù)提取鈍頂螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白;朱麗萍等［15］以溶脹法提取多管藻中的藻藍(lán)蛋白.但是，不同研究側(cè)重點(diǎn)不同，基于藻種不同，得到的結(jié)論存在差異.對于藻藍(lán)蛋白提取效果的評價，上述研究也主要基于提取液的藻藍(lán)蛋白濃度結(jié)果進(jìn)行，較少做吸收光譜方面的分析研究，而吸收光譜是藻藍(lán)蛋白濃度定量的基礎(chǔ)［22］.此外，已有的藻藍(lán)蛋白提取研究多側(cè)重于實(shí)驗室內(nèi)培養(yǎng)的藻類.太湖是富營養(yǎng)化嚴(yán)重的渾濁水體，湖泊中藻種多樣，藻種結(jié)構(gòu)也具有明顯的時空差異［23］.因此，在使用上述方法提取太湖水體中的藻藍(lán)蛋白時需要做具體分析.

本文以2011年8月20日采集的太湖梅梁灣藍(lán)藻水華樣品為研究對象，選取反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法提取水樣中的藻藍(lán)蛋白.基于光譜吸收特征和藻藍(lán)蛋白濃度統(tǒng)計結(jié)果對各種提取方法進(jìn)行評價，以期為太湖藍(lán)藻水華的監(jiān)測提供基礎(chǔ)支撐.

1 材料與方法

圖1 太湖梅梁灣采樣點(diǎn)分布Fig.1 Distribution of sampling sites in Meiliang Bay of Lake Taihu

1.1 樣品采集

水樣采自太湖梅梁灣湖區(qū)表層30 cm水體，共12個樣點(diǎn)(圖1).采集日期為2011年8月20日.采樣期間天氣晴朗，風(fēng)速為0.8～2.2 m/s.水樣采集后放入冷藏箱內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗室進(jìn)行分析.

藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品購自美國Sigma公司，編號為P6161.

1.2 樣品準(zhǔn)備

將野外采集的太湖水華溶液混勻，每種藻藍(lán)蛋白的提取方法分別平行采集相同體積的太湖樣品，采用1.2 μm孔徑的 Whatman GF/C濾膜真空泵抽濾，不同樣點(diǎn)采集的水樣水質(zhì)狀況不同，過濾體積稍有差異.以1#～12#表示各樣點(diǎn)水樣.

1.3 太湖藍(lán)藻水樣中藻藍(lán)蛋白的提取

分別參照下述方法提取1#～12#太湖藍(lán)藻水樣中的藻藍(lán)蛋白.每種提取方法設(shè)置3個平行樣.

反復(fù)凍融法［4］:將附著藻體的濾膜放入凍存管中，同時加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液于－20℃冰箱冷凍，然后室溫避光解凍，如此反復(fù)凍融7次.解凍的樣品以12000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取離心后的上清液作為待測液.

超聲波法［14］:將附著藻體的濾膜置于超聲波儀中，以0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液為溶媒，超聲波處理20 min(功率800 W).超聲波處理結(jié)束后以12000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取離心后的上清液作為待測液.

溶脹法［15］:將附著藻體的濾膜放入燒杯中，同時加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，在15℃的條件下溶脹提取，溶脹時間為3 d.提取結(jié)束后以12000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取離心后的上清液作為待測液.

丙酮法［8］:將附著藻體的濾膜放入試管中，同時加入90%的丙酮抽提脂溶性色素，以12000轉(zhuǎn)/min離心10 min.取上清液作為丙酮法的對比待測液，同時將剩余的藍(lán)色沉淀加一定量0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，置于磁力振蕩攪拌器上高速攪拌20 min，再以12000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取離心后的上清液作為丙酮法的待測液.

1.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品配置

使用0.05 mol/L 的磷酸鹽緩沖液，配置濃度為20、10、7、5、4、2、1 和 0.5 mol/L 的藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品系列，使用P1至P8表示.

1.5 藻藍(lán)蛋白濃度測定

使用島津UV-2450/UV-2550分光光度計測量各待測液和標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度.分光光度計掃描波長為350～750 nm，分辨率為1 nm.

根據(jù)Bennett等［3］的公式求取藻藍(lán)蛋白濃度:

式中，藻藍(lán)蛋白濃度CPC的單位為mg/ml;A615、A652分別是藻藍(lán)蛋白在615、652 nm處的吸光度.

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析在SPSS 16.0軟件中進(jìn)行.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取的藻藍(lán)蛋白吸收光譜結(jié)果

反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法提取的各樣品的藻藍(lán)蛋白吸收光譜如圖2，圖中各樣品的吸光度值以其平行樣的吸光度均值表示.

圖2 不同方法提取的藻藍(lán)蛋白吸收光譜Fig.2 Absorption spectrums of phycocyanin extracted by different methods

在350～750 nm的測量波長范圍內(nèi)，丙酮法藻藍(lán)蛋白提取液(圖2d)的吸收光譜形狀和吸收峰的位置與標(biāo)準(zhǔn)樣品(圖2f)一致.對比測量的丙酮上清液(圖2e)在波長430、480、620和670 nm處均具有吸收峰，且430、480和670 nm處吸收峰的峰高比620 nm強(qiáng).反復(fù)凍融法(圖2a)、超聲波法(圖2b)、溶脹法(圖2c)的藻藍(lán)蛋白提取液在620 nm附近出現(xiàn)主吸收峰，其中，反復(fù)凍融法620 nm的峰高最強(qiáng)，超聲波法最弱.此外，反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法獲取的部分水樣的藻藍(lán)蛋白提取液在670 nm附近還具有次吸收峰，其位于650～700 nm區(qū)間的譜型特征與標(biāo)準(zhǔn)樣品存在差異.

表1 樣品中藻藍(lán)蛋白含量的變異系數(shù)Tab.1 Variation coefficients of phycocyanin concentration in different samples

2.2 不同方法提取的藻藍(lán)蛋白濃度結(jié)果

以Bennett等的公式計算各提取方法對應(yīng)的1#～12#水樣的藻藍(lán)蛋白濃度值.由于不同點(diǎn)位的水質(zhì)狀況不同，水樣的平行樣的藻藍(lán)蛋白濃度均值具有差異.因而，文中使用變異系數(shù)(樣品平行樣的濃度值標(biāo)準(zhǔn)差與均值的比值)衡量不同方法提取的藻藍(lán)蛋白的差異性.變異系數(shù)如表1，平行樣的均值結(jié)果見圖3.反復(fù)凍融法、超聲波法不同水樣各個平行樣的變異系數(shù)均低于0.6(表1)，表明這兩種方法平行樣的結(jié)果具有較好的一致性，測量操作誤差較小.由不同方法提取的藻藍(lán)蛋白濃度比較結(jié)果(圖3)可知，反復(fù)凍融法提取的1#～12#太湖水樣的濃度值均高于其他3種方法，溶脹法次之，超聲波法的提取效果最不理想.

圖3 不同方法提取的藻藍(lán)蛋白濃度比較結(jié)果(T6和T8號太湖水樣的藻藍(lán)蛋白濃度較其他樣點(diǎn)高，為便于作圖比較，這兩個樣點(diǎn)的濃度值分別取其實(shí)際濃度值的1/10和1/20表示)Fig.3 Comparasion of the phycocyanin concentration under different extraction methods

3 討論

每種物質(zhì)都有自身的特征吸收光譜，吸收峰波長可以對已知物質(zhì)定性［22］.已有研究結(jié)果［3-21］表明，藻藍(lán)蛋白吸收峰位于620 nm附近.本文中反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法的藻藍(lán)蛋白提取液在620 nm附近具有吸收峰，反復(fù)凍融法620 nm的峰高最強(qiáng)，超聲波法最弱.這說明4種方法均能不同程度地提取出太湖藍(lán)藻水華樣品中的藻藍(lán)蛋白，其中，反復(fù)凍融法的提取效果優(yōu)于其他方法.反復(fù)凍融法(圖2a)、超聲波法(圖2b)、溶脹法(圖2c)獲取的部分水樣的藻藍(lán)蛋白提取液在670 nm附近還具有吸收作用，650～700 nm區(qū)間的譜型特征與標(biāo)準(zhǔn)樣品(圖2f)存在差異.這主要是由于反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法獲取的藻藍(lán)蛋白提取液均為粗提液，提取液中除了藻藍(lán)蛋白組分，還可能含有葉綠素蛋白復(fù)合體［7］、別藻藍(lán)蛋白［15］、細(xì)胞碎片［17］等物質(zhì)組分.這些物質(zhì)組分的存在會使得藻藍(lán)蛋白提取液的吸收光譜特征發(fā)生改變.余九九等［7］的研究結(jié)果表明，在以液氮凍融、超聲波破碎、蒸餾水低溫自溶、氯化鈣自溶4種方法提取出極大螺旋藻藻泥、藻粉中的藻藍(lán)蛋白的同時，鑲嵌于類囊體膜上的葉綠素蛋白復(fù)合體也會隨之脫落共存于提取液中，并對其670 nm附近的吸收光譜特性產(chǎn)生影響.本文中反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法獲取的部分水樣的藻藍(lán)蛋白提取液在670 nm附近出現(xiàn)吸收峰，說明用這3種方法提取太湖藍(lán)藻水華樣品中的藻藍(lán)蛋白時受到了葉綠素蛋白復(fù)合體的影響.此外，與反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法，以及余九九等［7］研究中的蒸餾水低溫自溶、氯化鈣自溶等方法不同，丙酮法先以丙酮作為浸提溶劑破壞藻體細(xì)胞結(jié)構(gòu).丙酮為有機(jī)溶劑，能使脂溶性的葉綠素a從復(fù)合體上脫落下來且以色素的形式溶于其中［18］.故而，在丙酮上清液棄除、磷酸鹽緩沖液再懸浮后獲取的藻藍(lán)蛋白提取液的吸收光譜上，未出現(xiàn)葉綠素蛋白復(fù)合體位于670 nm附近［24-25］的吸收峰(圖2d).

以往的研究［12，14］已證實(shí)了超聲波法能有效地破碎藻類細(xì)胞，提取出樣品中的藻藍(lán)蛋白.但是本實(shí)驗中，無論是從圖譜分析還是計算濃度值的統(tǒng)計結(jié)果來看，超聲波法的提取效果均不理想，提取不完全現(xiàn)象嚴(yán)重.究其原因，主要受研究對象的影響.與室內(nèi)培養(yǎng)的純藻種樣品不同，野外采集太湖水樣中的藻體多以包裹體形式存在［26］.包裹體表面附有群體膠鞘［27］，破壁所需的超聲強(qiáng)度較室內(nèi)藻種大.此外，朱麗萍等［15］和尹興娟等［18］的研究表明，藻藍(lán)蛋白熱穩(wěn)定性差，在40℃即發(fā)生變性.增加超聲波作用的強(qiáng)度和延長作用的時間均會導(dǎo)致熱效應(yīng)增加，使得細(xì)胞內(nèi)蛋白等有效組分的破壞.因此，在太湖藍(lán)藻水樣的藻藍(lán)蛋白提取中，單純用超聲波來破碎藻體細(xì)胞結(jié)構(gòu)是不夠的.

相較于超聲波法，溶脹法在620 nm藻藍(lán)蛋白特征峰處的峰值和相應(yīng)的計算濃度值均有所提高，但其提取率仍低于反復(fù)凍融法.譚嘯等［23］的研究表明太湖水體中藻種眾多，藻種結(jié)構(gòu)具有明顯的時空差異.余九九等［7］、韋萍等［9］的研究證實(shí)不同藻種所需溶脹溶劑不同.因此，多藻種共存可能是溶脹法提取效果不理想的一個影響因素.從吸收光譜圖(圖2)來看，溶脹法在350～500 nm光譜區(qū)間的吸光度值衰減率高于其他方法.溶脹法提取周期長，提取過程中藻體一直與液態(tài)溶劑接觸，導(dǎo)致藻體細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，產(chǎn)生的降解物增多，這可能是產(chǎn)生該差異的一個重要原因.此外，大量有機(jī)降解物的產(chǎn)生也會改變?nèi)芤旱膒H環(huán)境，使得藻藍(lán)蛋白活性降低［10］，反而不利于藻藍(lán)蛋白的提取.

丙酮法的藻藍(lán)蛋白提取液在670 nm附近未出現(xiàn)葉綠素蛋白復(fù)合體的吸收峰，但其在620 nm處的峰高低于反復(fù)凍融法和溶脹法.尹興娟等［18］的研究表明，藻藍(lán)蛋白由載體蛋白和藻藍(lán)素(發(fā)色團(tuán))組成.細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎后溶出的水溶性藻藍(lán)蛋白可溶于氯仿等有機(jī)溶劑中，變?yōu)橹苄缘脑逅{(lán)素.實(shí)驗中使用的丙酮為有機(jī)溶劑，能使脂溶性的色素溶于其中.因此，本文同時測量了丙酮法提取的丙酮上清液(圖2e)和再溶解后的藍(lán)色沉淀部分(圖2d)，并對其吸收光譜和濃度結(jié)果進(jìn)行了比較.吸收光譜圖中(圖2)，兩種待測液均在620 nm附近出現(xiàn)吸收峰，且二者的吸收峰強(qiáng)度相當(dāng)，說明丙酮法能提取出樣品中的部分藻藍(lán)蛋白，亦說明丙酮方法提取出的藻藍(lán)蛋白會以藻藍(lán)素的形式溶于丙酮而存在不同程度的損失.濃度統(tǒng)計結(jié)果(圖3)中丙酮法提取的藻藍(lán)蛋白濃度值小于反復(fù)凍融法和溶脹法也證明了這一點(diǎn).此外，在丙酮法提取中，上清液和藍(lán)色沉淀的分離存在不確定性，藍(lán)色沉淀部分再溶解也存在不完全現(xiàn)象，均會對其提取測量的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響.

吸收光譜的圖譜分析結(jié)果(圖2)和藻藍(lán)蛋白濃度計算結(jié)果(圖3)均表明，反復(fù)凍融法的提取效果明顯優(yōu)于其他方法.反復(fù)凍融法主要通過細(xì)胞內(nèi)冰粒的形成和剩余細(xì)胞液鹽濃度的增高引起溶脹，使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破碎，藻膽體內(nèi)的藻藍(lán)蛋白溶出.李冰等［12］的研究指出，藻藍(lán)蛋白在低溫狀態(tài)下具有較好地穩(wěn)定性.因此，當(dāng)樣品中存在包裹體且藻類組成不同時，可以通過增加反復(fù)凍融次數(shù)和降低凍融溫度的方式來提高提取率.此外，藻體在反復(fù)凍融提取的大部分時間里均處于結(jié)凍狀態(tài)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎降解產(chǎn)生有機(jī)質(zhì)的含量較溶脹法小，pH環(huán)境穩(wěn)定，易于保持藻藍(lán)蛋白的活性.但是，與超聲波法、溶脹法類似，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎藻藍(lán)蛋白溶出的同時，位于類囊體膜上的葉綠素蛋白復(fù)合體也同時釋放出來.從吸收光譜圖(圖2)來看，葉綠素蛋白復(fù)合體位于670 nm附近的吸收峰對650 nm處的吸光度產(chǎn)生了影響.考慮到常用的藻藍(lán)蛋白濃度計算公式［3，5］中定義的650 nm處吸光度為別藻藍(lán)蛋白的吸收，因此，在以后的研究工作中，還需要開展更多的實(shí)驗對比工作來分析葉綠素蛋白復(fù)合體對太湖水樣中藻藍(lán)蛋白提取的影響.

綜上所述，反復(fù)凍融法的提取效果明顯優(yōu)于其他方法，可推薦作為一種太湖藍(lán)藻水樣中藻藍(lán)蛋白的實(shí)驗室提取方法.

致謝:太湖水樣采集得到了南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院研究生王磊、孫曉鵬、周宇的幫助，藻藍(lán)蛋白的提取實(shí)驗得到了南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李建宏教授的指導(dǎo)以及研究生夏明升的幫助，在此表示衷心感謝.

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