周 穎，魏寶陽，王 智，李超民，羅翔宇，肖安琪

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128）

自1996年，全球第一例轉(zhuǎn)基因作物在美國開始商品化種植生產(chǎn)以來，轉(zhuǎn)基因作物就開始大面積推廣，到2011年全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積由2010年的14 800 萬hm2增加8.1%達(dá)到16 000 萬hm2[1]。2009年我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了2 個抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻品系的安全證書后[2-4]，Bt 作物更是得到廣泛的關(guān)注。Harwood 等[5]研究表明，轉(zhuǎn)Bt 基因玉米中的Cry1Ab 蛋白可通過食物鏈的傳遞轉(zhuǎn)移到玉米地中的相關(guān)天敵玉米跳甲、日本金龜子等動物的體內(nèi)。姜永厚等[6]研究表明，取食轉(zhuǎn)Bt 水稻的褐飛虱（Nilaparvata lugens）、稻蚜（Sitobion avenae）以及用取食轉(zhuǎn)Bt 水稻的二化螟或稻眼蝶幼蟲喂食的擬水狼蛛（Pirata subpiraticus）體內(nèi)都能檢測出Cry1Ab 蛋白，這些研究都表明Bt 蛋白能夠隨著食物鏈進(jìn)行傳遞。但是，Bt 蛋白隨著食物鏈進(jìn)行傳遞過程中在蜘蛛體內(nèi)的富集情況、時間效應(yīng)以及對蜘蛛體內(nèi)的相關(guān)的酶活性的影響還有待研究。以擬環(huán)紋豹蛛為主要試驗(yàn)材料，研究了Cry1Ab 蛋白在蜘蛛體內(nèi)的富集及對蜘蛛相關(guān)酶活性的影響，以期為轉(zhuǎn)Bt 水稻安全性評價提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 供試水稻 轉(zhuǎn)Cry1Ab 基因水稻汕優(yōu)63（簡稱Bt 水稻）與對照品種親本汕優(yōu)63 均由湖南師范大學(xué)提供，Bt 水稻和對照品種在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)盆栽進(jìn)行培養(yǎng)。水稻在生長期內(nèi)不噴灑任何農(nóng)藥，其他管理均為常規(guī)管理。

1.1.2 供試稻飛虱 以湖南省農(nóng)科院水稻所試驗(yàn)田捕捉的褐飛虱為材料，在實(shí)驗(yàn)室盆栽水稻中進(jìn)行培養(yǎng)，對照組取食對照水稻，試驗(yàn)組取食Bt 水稻。

1.1.3 供試蜘蛛 擬環(huán)紋豹蛛采集于湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻所試驗(yàn)田，采回后分裝于試管內(nèi)，饑餓48 h 后分別以取食10～15 d 的對照組（即普通汕優(yōu)63水稻）和試驗(yàn)組（即Bt 水稻）盆栽水稻的褐飛虱進(jìn)行飼養(yǎng)，提供充足的稻飛虱和水，在溫度25℃、濕度70%的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行喂養(yǎng)。喂食褐飛虱5、10、15 d 后的蜘蛛在冰水中用勻漿器進(jìn)行勻漿后，4 000 r/min 離心，取上清液作為酶源。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計 試驗(yàn)設(shè)2 個處理，蜘蛛饑餓48 h 后，試驗(yàn)組以取食10～15 d Bt 水稻的褐飛虱飼養(yǎng)，對照組以取食10～15 d 普通汕優(yōu)63 水稻的褐飛虱飼養(yǎng)。試驗(yàn)期間提供充足的稻飛虱和水，在溫度25℃、濕度70%的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行喂養(yǎng)。喂食褐飛虱5、10、15 d 后的蜘蛛在冰水中用勻漿器進(jìn)行勻漿后，4 000 r/min 離心，取上清液作為酶源。

1.2.2 數(shù)據(jù)測定 （1）蜘蛛體內(nèi)可溶性蛋白的測定：可溶性蛋白采用考馬斯亮G-250 法[7]，以牛血清蛋白做蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）酶活力的測定：乙酰膽堿酯酶（AchE）活力測定參照高希武[8]的方法，超氧化物歧化酶（SOD）活力和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力用南京建成公司生產(chǎn)的相關(guān)試劑盒進(jìn)行測定，測定嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。（3）Bt蛋白含量的測定：Bt蛋白含量測定采用由美國Agdia 公司提供的Bt-Cry1Ab/Ac ELISA 平板試劑盒測定。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用Excel 2003 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻飛虱和蜘蛛體內(nèi)Cry1Ab 蛋白含量的變化

由表1 可知，取食Bt 水稻后，在0～5 d 內(nèi)，褐飛虱體內(nèi)的Bt 蛋白含量很低，幾乎沒有檢測到，在5～15 d 內(nèi)，褐飛虱體內(nèi)的Bt蛋白含量逐漸上升，在第15 天時到達(dá)最高。故研究采用取食Bt 水稻10～15 d 內(nèi)的褐飛虱喂食蜘蛛。

表1 褐飛虱、擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)Cry1Ab 蛋白含量

喂食取食Bt蛋白10 d 的稻飛虱后，在5～15 d內(nèi)，蜘蛛體內(nèi)均檢測到Bt蛋白含量，在第10 天Bt蛋白含量達(dá)到最高，10 d 后呈逐漸下降趨勢，但在第15 天時，蜘蛛體內(nèi)的Bt 蛋白含量仍高于第5 天時的水平。蜘蛛體內(nèi)Bt蛋白的最高含量高于稻飛虱體內(nèi)Bt蛋白的最高含量，說明Bt蛋白沿“Bt 水稻—稻飛虱—蜘蛛”這一條食物鏈傳遞時具有生物富集效應(yīng)。

2.2 蜘蛛體內(nèi)相關(guān)酶活力的變化

2.2.1 AchE 活力的變化 如表2 所示，在喂食含有Bt蛋白的稻飛虱5 d 后，試驗(yàn)組擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的AchE 活力較對照組的出現(xiàn)了略微升高；在喂食10 d 后，當(dāng)擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的Bt蛋白含量達(dá)到最高值時，試驗(yàn)組擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的AchE 低于對照組；在喂食15 d 時，試驗(yàn)組擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的AchE 活力高于對照組，但沒有達(dá)到顯著性差異（P>0.05）。由此推測，AchE 活力的變化可能與Bt蛋白的含量存在負(fù)相關(guān)性。

表2 Cry1Ab 蛋白富集作用對擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)酶活力的影響 （U/mg）

2.2.2 SOD 活力的變化 如表2 所示，在喂食含有Bt 蛋白的褐飛虱5 d 后，試驗(yàn)組擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的SOD 活力較對照組的略低，可能是Bt蛋白的富集對蜘蛛體內(nèi)的酶活力出現(xiàn)了抑制作用；在喂食10 d 后，擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的Bt蛋白含量處于最高值，試驗(yàn)組擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的SOD 活力高于對照組，由于Bt蛋白的富集，造成蜘蛛體內(nèi)自由基含量較多，SOD 對其進(jìn)行消除；在喂食15 d 時，試驗(yàn)組擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的SOD 活力均低于對照組，可能是由于Bt蛋白的富集造成整個擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的SOD 活性無法調(diào)控，從而抑制酶活力。但是，在整個試驗(yàn)期間試驗(yàn)組的擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的SOD 活力與對照組相比，均沒有達(dá)到顯著性差異（P>0.05）。

2.2.3 GSH-Px 活力的變化 如表2 所示，在喂食含有Bt蛋白的稻飛虱5 d 后，試驗(yàn)組擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的GSH-Px 活力略高于對照組；但在喂食10 d后，擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的Bt蛋白含量達(dá)到最高值時，試驗(yàn)組擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的GSH-Px 活力低于對照組，且存在極顯著性差異（P<0.01）。這可能是由于蜘蛛體內(nèi)的保護(hù)機(jī)制開始能夠消除Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)酶活力的影響，但由于Bt蛋白的大量富集，超出了保護(hù)機(jī)制的范圍，導(dǎo)致酶活力受到抑制。在喂食15 d 后，試驗(yàn)組擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的GSH-Px活力仍然低于對照組，說明GSH-Px 活力的恢復(fù)需要一定的時間。由此推測，GSH-Px 活力的變化可能與Bt 蛋白的含量存在負(fù)相關(guān)性。

3 討 論

該研究中Bt 蛋白能夠隨著“Bt 水稻—稻飛虱—蜘蛛（擬環(huán)紋豹蛛）”食物鏈進(jìn)行傳遞，并具有生物放大效應(yīng)；擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的Bt 蛋白含量隨著時間變化而變化，當(dāng)Bt 蛋白增長到一定的程度后，逐漸出現(xiàn)下降的趨勢，這和陳茂等[9]研究結(jié)果一致，可能與蜘蛛體內(nèi)存在相關(guān)保護(hù)機(jī)制有關(guān)，其具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

Bt 蛋白在蜘蛛體內(nèi)的富集造成蜘蛛體內(nèi)相關(guān)酶活力的變化。喂食5 d 時，Bt 蛋白含量開始在體內(nèi)積累，蜘蛛體內(nèi)相關(guān)的保護(hù)酶，主要是GSH-Px活力升高，來抵御Bt 蛋白的影響，同時蜘蛛體內(nèi)的AchE 活力也升高，通過在神經(jīng)方面的某些調(diào)控作用來對Bt 蛋白活力起到防御作用；而SOD 活力下降，可能是由于Bt蛋白對其產(chǎn)生抑制作用所致。隨著Bt 蛋白的持續(xù)積累，在喂食10 d 后，蜘蛛體內(nèi)的AchE 和GSH-Px 活力出現(xiàn)最低值，其中GSHPx 活力與對照組差異達(dá)極顯著水平，可能是因?yàn)锽t 蛋白的持續(xù)作用超出酶活力能夠調(diào)控的范圍，使酶活力反而受到抑制；而SOD 活力在此時升高，可能是由于大量Bt 蛋白積累，激活了其體內(nèi)防御機(jī)制所致。之后，蜘蛛體內(nèi)的防御機(jī)制導(dǎo)致Bt 蛋白含量下降，GSH-Px 和AchE 活力開始不斷恢復(fù)，在喂食15 d 時均還略高于對照組。

在該研究中，酶活力的變化情況和張志罡等[10]報道的Cry1Ab 蛋白對稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)AchE活力先迅速上升后有劇烈下降趨勢，以及SOD 先穩(wěn)定平緩后急劇升高又迅速下降趨勢不一致；和郭文娟等[11]報道的基因水稻對大螟幼蟲體內(nèi)3 種保護(hù)酶的變化情況以及張雁等[12]報道的轉(zhuǎn)Bt 基因南林895 楊對楊扇舟蛾體內(nèi)酶的變化情況均不相同，這可能是由于Bt 蛋白對靶標(biāo)生物和非靶標(biāo)生物的作用機(jī)理不一致所造成的。

[1]孫雷心.國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）發(fā)布轉(zhuǎn)基因作物年度發(fā)展報告[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（4）：616.

[2]李黎紅，葉衛(wèi)軍，郭龍彪.我國轉(zhuǎn)基因水稻研究進(jìn)展和商業(yè)化前景分析[J].中國稻米，2012，18（6）：1-4.

[3]蔣建科． 轉(zhuǎn)基因水稻能不能放心吃[N].人民日報，2010-02-01.

[4]王 佳.200 億元財政攪動轉(zhuǎn)基因水稻商業(yè)“神經(jīng)”[N].中國經(jīng)營報，2010-01-17.

[5]Harwood J K，Wallin W G.，Obrycki J J.Uptake of Bt endotoxins by nontarget herbivores and highter arthropod predators：molecular evidence from a transgenic corn agroecosystem[J].Mol.Ecol，2005，14（9）：2815-2823.

[6]姜永厚，付 強(qiáng)，程家安.轉(zhuǎn)Bt 基因水稻表達(dá)的毒蛋白Cry1Ab在害蟲及其捕食者體內(nèi)的積累動態(tài)[J].昆蟲學(xué)報，2004，47（4）：454-460.

[7]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgam quantities of protein utilizing the principle proteindye binding[J].Anal.Biochem，1976，72：248-254.

[8]高希武.Gorun 等改進(jìn)的Ellman 膽堿酯酶活性測定方法介紹[J].昆蟲知識，1987，24（4）：425-246.

[9]陳 茂，葉恭銀，盧新民.Cry1Ab 殺蟲蛋白在水稻—褐飛虱—擬環(huán)紋豹蛛食物鏈中轉(zhuǎn)移與富集[J].昆蟲學(xué)報，2005，48（2）：208-213.

[10]張志罡，孫繼英，李 勇.Cry1Ab 蛋白對稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)三種保護(hù)酶活性的影響[J].生物技術(shù)通報，2011，（1）：148-152.

[11]郭文娟，陸馳宇，熊應(yīng)強(qiáng).轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac 基因水稻對大螟幼蟲體內(nèi)三種保護(hù)酶活性的影響[J].昆蟲學(xué)報，2012，55（8）：958-963.

[12]張 雁，郭同斌，諸葛強(qiáng).轉(zhuǎn)Bt 基因南林895 楊對楊扇舟蛾體內(nèi)酶的影響[J].林業(yè)科學(xué)，2012，48（6）：95-99.