黃國韋

（汕頭大學(xué) 醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041）

隨著功能基因組學(xué)研究的不斷深入，蛋白研究變得越來越迫切和重要.近紅外雙色激光蛋白檢測技術(shù)，為國內(nèi)蛋白功能研究者提供了極其重要的研究工具，其主要應(yīng)用包括：WesternBlot檢測、In CellWestern檢測、EMSA和活體成像等.該技術(shù)利用近紅外激光低背景，高靈敏度的特點(diǎn)，對(duì)蛋白及磷酸化蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測；而且增加了蛋白定量的線性范圍.本文試就其定量原理、方法及應(yīng)用作一介紹，對(duì)推動(dòng)廣大從事基礎(chǔ)研究的學(xué)生，特別是研究生本身的科研水平具有重要作用.

1 近紅外雙色成像技術(shù)的原理[1-2]

LI-COR根據(jù)紅外熒光的這一特點(diǎn)開發(fā)出Odyssey紅外成像系統(tǒng)，獨(dú)特的采用2個(gè)紅外激光作為激發(fā)光源，以掃描成像方式對(duì)樣品進(jìn)行檢測.樣品載體可以是膜、凝膠和微孔板.該系統(tǒng)配置的2個(gè)紅外激光激發(fā)光源，激發(fā)光波長分別為680nm和780nm，配置的2個(gè)高靈敏度光敏二極管可以分別檢測720nm和820nm的發(fā)射熒光，因而Odyssey可同時(shí)檢測兩種IRDyes染料的熒光信號(hào).IRDyes染料的最大吸收值與Odyssey的兩個(gè)紅外激光器680nm和780nm激發(fā)波長相匹配，其發(fā)射光波長又與Odyssey的兩個(gè)光敏二極管檢測波長相匹配，與同時(shí)IRDye700和IRDye800的發(fā)射波長峰值相隔100nm，因此Odyssey可以給出最大的靈敏度和最小的信號(hào)交叉.

2 近紅外雙色成像技術(shù)應(yīng)用范圍

Odyssey紅外激光成像技術(shù)可以使用于蛋白定量、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激酶研究、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和凋亡、藥物篩選等領(lǐng)域.

3 近紅外雙色成像技術(shù)的應(yīng)用舉例

3.1 定量Western檢測

膜經(jīng)一抗孵育，再經(jīng)熒光標(biāo)記抗體孵育后進(jìn)行Odyssey掃描成像，由于熒光信號(hào)強(qiáng)度與蛋白豐度具有更好的線性相關(guān)性，具備靈敏度高、定量準(zhǔn)確、雙色檢測的特點(diǎn).如下圖所示：

圖1 近紅外雙色成像技術(shù)進(jìn)行定量Western檢測

3.2 ERK磷酸化檢測

觀察EGF刺激后A431細(xì)胞中ERK1and ERK2(p44/42MAPkinases)的磷酸化情況,一抗分別是兔抗ERK抗體和小鼠抗磷酸化ERK抗體,二抗用抗兔的IRDye800標(biāo)記的抗體(green),和抗鼠的Alexa680標(biāo)記的抗體(red).結(jié)果如下圖所示：

圖2 ERK磷酸化檢測

3.3 EMSA實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

EMSA(Electrophoretic Mobility ShiftAssay)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)是研究DNA與蛋白質(zhì)或RNA與蛋白質(zhì)相互作用的常用技術(shù).該技術(shù)是基于DNA/蛋白質(zhì)或RNA/蛋白質(zhì)復(fù)合體在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中有不同遷移率的原理.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與一條人工合成的特異的DNA或RNA結(jié)合后，其在PAGE中的遷移率將小于未結(jié)合的DNA，從而檢測到活化的與DNA或RNA結(jié)合的蛋白，一般為轉(zhuǎn)錄或調(diào)控因子.起初是用32P同位素標(biāo)記寡核苷酸探針,但是由于同位素的放射性很強(qiáng),而且半衰期為14天,從定購?fù)凰氐綐?biāo)記，做完試驗(yàn),必須14天完成,既不安全也不方便；地高辛標(biāo)記探針的非放射EMSA實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其缺陷是標(biāo)記的探針純化后靈敏度弱；紅外熒光技術(shù)的出現(xiàn)，可以解決EMSA實(shí)驗(yàn)中的探針示蹤問題，還可以進(jìn)行雙色標(biāo)記，檢測競爭性結(jié)合.如下圖所示：

圖3 近紅外成像技術(shù)檢測T7RNP結(jié)合到T7啟動(dòng)子序列

4 掌握近紅外成像技術(shù)的必要性

隨著醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究的飛速發(fā)展，越來越多的科研人員希望將分子及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)從傳統(tǒng)的體外研究延伸到活體動(dòng)物體內(nèi)，以直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因表達(dá)，有效地研究觀測轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生理過程，譬如活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)生發(fā)展過程等.活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像分為生物發(fā)光和熒光兩種技術(shù).生物發(fā)光是利用熒光素酶基因標(biāo)記目的核酸和細(xì)胞，在ATP和氧氣存在時(shí)，通過熒光素酶催化注射進(jìn)體內(nèi)的底物熒光素，實(shí)現(xiàn)發(fā)光過程.熒光技術(shù)則是采用熒光素或熒光素基因標(biāo)記多肽、抗體、小分子藥物，在外界光源的激發(fā)下產(chǎn)生熒光.而傳統(tǒng)熒光技術(shù)作為臨床研究潛在的有力工具，自身的生物發(fā)光信號(hào)遠(yuǎn)弱于熒光信號(hào)，而且光在體內(nèi)的傳播會(huì)被散播和吸收，需要高靈敏度的檢測儀器，成本非常昂貴.同時(shí)，發(fā)光幾乎都是酶-底物類型的反應(yīng)，需要涉及不同種類轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，復(fù)雜程度較高，所以和熒光技術(shù)相比，更容易受反應(yīng)體系中的成分影響.傳統(tǒng)熒光由于自發(fā)熒光干擾、光的組織吸收、靈敏度較低的特點(diǎn)阻礙了在活體動(dòng)物體內(nèi)成像的應(yīng)用.近紅外光譜由于良好的組織滲透性、無毒性和放射性等特點(diǎn)，可以真正無損傷地研究各項(xiàng)生理指標(biāo)，數(shù)據(jù)結(jié)果真實(shí)可靠.

因此，廣大科研工作者應(yīng)該掌握近紅外成像技術(shù)，在科研工作中加以廣泛的應(yīng)用，必將大力推動(dòng)基礎(chǔ)科研工作的發(fā)展.

〔1〕Philip R.Christensen, Bruce M.Jakosky,Hugh H.Kieffer，et al.The thermal emission imaging system (Themis)for the Mars 2001 Odyssey mission.USA: Mars Odyssey[J].2004,110(3):85-130.

〔2〕Suresh T.Mathews,Eric P.Plaisance,Teayoun Kim.Imaging systems for westerns:chemiluminescence versus infrared detection.Methods in Molecular Biology.2009,536(5):499-513.