羅時鵬 余資江 肖朝倫 余 彥 康朝勝 孫寶飛 李玉美

(貴陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，貴州 貴陽 550004)

隨著對腦缺血研究的進展，人們早已打破了成年人腦神經(jīng)元不能再生的理論〔1〕。新近研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后原處于靜止狀態(tài)的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞(NSCs)被激活，并增殖分化為新生細胞。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Wnt/β-catenin信號通路是細胞增殖分化的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)，與腦損傷后的修復有關(guān)。本研究檢測經(jīng)典Wnt信號通路中兩個關(guān)鍵信號分子Wnt1、Wnt3a在小鼠缺血再灌注后海馬組織中的表達和變化規(guī)律，探討Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路在腦缺血再灌注損傷中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 健康1月齡雄性昆明小鼠80只，體重18～25 g，由貴陽醫(yī)學院動物實驗中心提供〔合格證號:SCXK(黔)2002-0001〕。隨機分為正常組、假手術(shù)組和缺血再灌注后1、3、7、14、21、28 d 組，每組各 10 只。鼠抗 5-溴脫氧尿嘧啶核甘(BrdU)單克隆抗體購自武漢博士德生物工程公司，小鼠Wnt1、Wnt3a原位雜交檢測試劑盒均購自天津灝洋生物制品有限公司，DAB顯色試劑盒購自福建邁新公司。

1.2 腦缺血再灌注模型制備及BrdU標記 建立小鼠缺血再灌注腦損傷模型，術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。5%水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠后，仰臥固定于手術(shù)操作臺，頸前部皮毛常規(guī)消毒，行頸部正中切口，長約2 cm，逐層分離暴露雙側(cè)頸總動脈及伴行的迷走神經(jīng)，無創(chuàng)微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，造成全腦缺血〔2〕。30 min后松開動脈夾恢復再灌注，縫合切口，術(shù)中保持動物肛溫(36.6±0.5)℃;假手術(shù)組不予夾閉頸總動脈，其余操作同實驗組。各組小鼠均于取腦時間點前24 h，隨機抽取10只小鼠行腹腔注射BrdU，50 mg/kg×3次，每次間隔4 h，并于末次注射12 h后處死。

1.3 取材與切片 模型建立后，于各相應時間點以4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定后取腦。取出腦組織用4%多聚甲醛溶液固定過夜。石蠟包埋組織塊，冠狀連續(xù)切片，片厚5 μm，連續(xù)貼片，行BrdU免疫組化顯色和原位雜交。

1.4 BrdU免疫組織化學染色步驟 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用3%H2O2滅活內(nèi)源性酶10 min，行抗原修復后，分別滴加一抗 (山羊抗小鼠β-catinen、cyclineD1多克隆抗體)，陰性對照以PBS代替一抗，4℃過夜，滴加通用型二抗，進行DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以胞質(zhì)或胞核中出現(xiàn)棕黑色或棕黃色顆粒為陽性細胞。

1.5 Wnt1、Wnt3a多點標記的地高辛探針原位雜交步驟 ①石蠟切片脫蠟至水;②0.01 mol/L PBS沖洗3次;③滴加過氧化氫封閉液，室溫，20 min，封閉內(nèi)源性過氧化氫酶;④0.01 mol/L PBS沖洗3次;⑤滴加復合消化工作液，室溫，30 min;⑥0.01mol/L PBS沖洗3次;⑦0.2×SSC沖洗1次，室溫，3 min;⑧滴加預雜交工作液，37℃濕盒孵育1 h;⑨0.2×SSC沖洗，5 min×3次，室溫;⑩滴加雜交工作液，37℃濕盒孵育4 h;○11 2× SSC 沖洗，5 min× 3 次，37℃;○120.2 × SSC 沖洗，5 min×3 次，37℃;○130.01 mol/L PBS 沖洗，5 min ×3 次，37℃;○14滴加小鼠抗地高辛生物素標記的抗體工作液，37℃濕盒孵育45 min;○150.01 mol/L PBS 沖洗，5 min ×3 次;○16滴加高敏過氧化物酶鏈親和素復合物工作液，37℃濕盒孵育45 min;○17 0.01 mol/L PBS 沖洗，5 min ×3 次;○18DAB 顯色;○19梯度乙醇脫水，每步5 min;○20二甲苯透明;○21中性樹膠封片。

1.6 圖像分析 采用CMIAS真彩色醫(yī)學圖像免疫組化自動分析系統(tǒng)計數(shù)陽性細胞。每只小鼠隨機取5張切片，在200倍光鏡下，每張切片取6個視野，計數(shù)每個視野海馬齒狀回顆粒細胞下層的陽性細胞數(shù)，以平均值代表各組陽性數(shù)結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件，計量資料以±s表示，進行F檢驗。

2 結(jié)果

2.1 BrdU免疫組化染色 正常組(4.28±0.57)和假手術(shù)組小鼠海馬齒狀回顆粒細胞下層可見少量BrdU陽性細胞，缺血再灌注后3 d BrdU陽性細胞開始增加，缺血再灌注后7 d達高峰(P＜0.05)，隨著灌注時間的延長BrdU陽性細胞數(shù)呈下降趨勢，缺血再灌注后14 d開始減少，依舊高于正常水平(P＜0.05)。缺血再灌注后28 d BrdU陽性細胞數(shù)降至正常水平(P ＞0.05)。見圖1，表1。

2.2 Wnt1、Wnt3a原位雜交結(jié)果 正常組和假手術(shù)組海馬齒狀回顆粒細胞下層均無明顯Wnt1、Wnt3a陽性表達。缺血再灌注各組均可見Wnt1、Wnt3a陽性細胞，再灌注后1 d表達開始增加，14 d達高峰，28 d減少至正常水平。與正常組和假手術(shù)組比較，均明顯增多(P＜0.05)。見圖2、圖3，表2、表3。

圖1 各實驗組海馬齒狀回區(qū)BrdU陽性細胞(SP，×200)

表1 各組小鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞計數(shù)(n=10，±s)

表1 各組小鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞計數(shù)(n=10，±s)

與正常組比較:1)P＜0.05

2±0.52 5.61±1.06缺血再灌注組 15.51±1.021) 20.13±3.471) 55.42±1.971) 14.52±1.911) 12.20±1.191) 4.94±0.641)1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d假手術(shù)組 2.96±0.46 3.29±0.52 4.62±1.13 4.94±1.44 4.6組別

表2 各組小鼠海馬齒狀回Wnt1陽性細胞計數(shù)(n=10，±s)

表2 各組小鼠海馬齒狀回Wnt1陽性細胞計數(shù)(n=10，±s)

與正常組、假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與缺血再灌注后14 d組比較:2)P＜0.05，下表同

0.38±0.18 - - - - -假手術(shù)組 0.37±0.17 - - - - -缺血再灌注組 4.00±0.461)2) 6.88±0.441)2) 15.00±1.461)2) 20.13±1.081) 18.75±0.801) 1.38±0.381)2)1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d正常組指標

表3 各組小鼠海馬齒狀回Wnt3a陽性細胞計數(shù)(n=10，±s)

表3 各組小鼠海馬齒狀回Wnt3a陽性細胞計數(shù)(n=10，±s)

指標0.36±0.16 - - - - -假手術(shù)組 0.35±0.15 - - - - -缺血再灌注組 3.95±0.451)2) 6.80±0.431)2) 14.84±1.441)2) 19.92±1.061) 18.55±0.791) 1.36±0.371)2)1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d正常組

圖2 各組海馬齒狀回區(qū)Wnt1陽性細胞(SP，×200)

圖3 各組海馬齒狀回區(qū)Wnt3a陽性細胞(SP，×200)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦損傷造成神經(jīng)元退行性變的同時，也促進了神經(jīng)再生〔3〕。進一步的研究顯示成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在具有自我更新和多向分化潛能的NSCs〔4〕。NSCs是神經(jīng)系統(tǒng)中未發(fā)育成熟的神經(jīng)前體細胞。主要位于側(cè)腦室室管膜下區(qū)(SVZ)和海馬齒狀回顆粒細胞下層區(qū)(SGZ)〔5〕。它具有自我更新和多分化潛能，能通過不對稱分裂產(chǎn)生各種神經(jīng)細胞的功能。正常情況下神經(jīng)干細胞處于靜止狀態(tài)，但在損傷、缺血等刺激因素的作用下可被激活，發(fā)生增殖、遷移、分化等一系列變化來替代壞死的神經(jīng)細胞，修復損傷、恢復神經(jīng)功能〔6〕。

BrdU作為胸腺嘧啶核苷的衍生物，可代替胸腺嘧啶在細胞有絲分裂的S期作為原料摻入到細胞合成的DNA中，只要細胞不消亡，BrdU就在細胞核的DNA中長期存留。摻入到細胞DNA中的BrdU可通過抗BrdU單克隆抗體在組織切片上顯示。實驗中常采用活體注射或細胞培養(yǎng)加入BrdU后，利用抗BrdU單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細胞。本實驗可見在正常情況下，NSCs處于靜止狀態(tài)，在受到腦缺血再灌注損傷的刺激后，內(nèi)源性NSCs開始增殖，灌注后7 d NSCs增殖達高峰，隨后細胞增殖逐漸降低。國外研究顯示，腦缺血后NSCs具有增殖能力，參與腦缺血的病理生理過程〔7〕，與本研究結(jié)果一致。這說明小鼠腦缺血再灌注損傷可激發(fā)內(nèi)源性NSCs的增殖。

近年來研究表明，缺血性腦損傷造成神經(jīng)元退行性變的同時，也促進了神經(jīng)再生，Wnt信號途徑與NSCs的增殖及神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān)，認為Wnt信號途徑與腦損傷后的修復有關(guān)〔8〕。Wnt/β-catenin信號傳導通路由配體(Wnt家族分子)、跨膜受體(Frizzled家族分子和CRP-5/6)、胞漿調(diào)節(jié)蛋白(DSH、APC、AXIN、GSK-3β、β-catenin)以及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(TCF/LEF)等組成〔9〕。其中Wnt蛋白為脂質(zhì)修飾的分泌型蛋白富含半朧氨酸，目前哺乳動物基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)19種Wnt基因，可劃分為兩大亞族:Wnt-1和 Wnt-5a亞族。Wnt-1亞族包括 Wntl，2，3，3a，7a，8 等;Wnt-5a亞族包括 Wnt4，5a，6，11 等。其中 Wnt-l亞族激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路〔10〕，對NSCs增殖及分化有一定的調(diào)控作用，對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有重要作用。Wnt家族是Wnt信號傳導通路中的啟動因子，當受到Wnt蛋白信號刺激時，Wnt蛋白就與跨膜受體Frizzelds以及共同受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP-5、LRP-6)結(jié)合，作為Wnt信號通路活化的重要起始信號。

Wnt-1蛋白是控制細胞生長、增殖的關(guān)鍵分泌信號分子，可傳遞細胞間相互調(diào)控信息〔11〕。Wnt-1的缺失可引發(fā)中腦和小腦的嚴重缺陷，Wnt-3a的缺失可引起海馬整體功能的喪失〔12〕。Wnt3a是WNT基因家族中的重要成員，在胚胎發(fā)育期Wnt3a信號蛋白在Wnt基因家族成員中最先表達〔13〕。Wnt3a是Wnt信號通路中重要的激活劑，大量研究已表明它表達的增加可促進細胞的分裂、加速分化增殖〔14〕。早期國外學者使用純化獲得的Wnt3a蛋白使體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞大量增殖〔15〕。近期我國學者研究發(fā)現(xiàn)Wnt3a蛋白在胚胎發(fā)育時期不僅激活了Wnt信號通路，還促進 NSCs的增殖〔16〕。Davidson 等〔17〕通過添加Wnt3a觀察發(fā)現(xiàn)，Wnt3a不僅能提高NSCs的數(shù)量，還能有效促進克隆球體積的增大。由此可見Wnt3a在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、維持NSCs自我更新和分化的過程具有重要作用。

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