王 曄 吳晨鵬 徐晉珩 劉 巖 (唐山市工人醫(yī)院泌尿外科，河北 唐山 063000)

引起腫瘤血管生成的因素很多，但其作用機(jī)制并不完全清楚。Galectin-3作為凝集素蛋白家族成員之一，參與細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、腫瘤的轉(zhuǎn)化和凋亡等〔1，2〕?；|(zhì)金屬蛋白酶-14(MMP-14)可激活MMP-2降解細(xì)胞外基質(zhì)，其高表達(dá)在腫瘤進(jìn)展中具有一定作用〔3〕。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)膀胱尿路上皮癌中Galectin-3、MMP-14和CD34的表達(dá)，探討血管生成對(duì)判斷預(yù)后的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2003年1月至2006年10月在唐山市工人醫(yī)院行膀胱尿路上皮癌切除術(shù)的存檔蠟塊作為觀察組。病例納入標(biāo)準(zhǔn):①符合WHO分類中泌尿系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理學(xué)主治醫(yī)師確診;②納入患者手術(shù)前均未進(jìn)行任何放、化療;③臨床隨訪資料完整。本組共收集80例，其中男50例，女30例，年齡38～78〔平均(59.7±7.0)〕歲。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。同時(shí)選擇距腫物邊緣＞5 cm處的癌旁正常黏膜組織50例作為對(duì)照組，其中男31例，女19例，年齡37～77〔平均(59.5±7.4)〕歲。兩組常規(guī)指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 Galectin-3、MMP-14和CD34的檢測(cè)方法 均采用免疫組織化學(xué)(SP)法，試劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，具體操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，均由病理科專業(yè)技術(shù)人員完成，嚴(yán)格質(zhì)控。

1.2.2 判斷方法 所有切片均由病理科兩位主治醫(yī)師閱片并記錄。Galectin-3和MMP-14陽(yáng)性表達(dá)部位為細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)中有棕褐色顆粒染色為陽(yáng)性;每個(gè)切片于高倍鏡下隨意取5個(gè)不重復(fù)視野陽(yáng)性細(xì)胞，以陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比分為三級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥5%為陽(yáng)性，其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%為弱陽(yáng)性(+)，≥25%為強(qiáng)陽(yáng)性(?)。CD34標(biāo)記的微血管計(jì)數(shù)(MVD)方法:先在低倍鏡下觀察染色的最豐富區(qū)，然后在高倍鏡下分別計(jì)數(shù)，每個(gè)陽(yáng)性染色的內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇或單個(gè)小脈管均視為1個(gè)微血管。每例計(jì)數(shù)4個(gè)視野，取其平均值作為MVD〔3〕。以MVD≥25為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS6.12軟件進(jìn)行分析，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，相關(guān)分析應(yīng)用線性相關(guān)分析，并對(duì)患者進(jìn)行生存分析。

2 結(jié)果

2.1 Galectin-3、MMP-14和MVD在觀察組與對(duì)照組中的表達(dá)Galectin-3和MMP-14在觀察組中表達(dá)的陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，觀察組中MVD明顯高于對(duì)照組(均P＜0.01)。見表1。

2.2 Galectin-3、MMP-14和MVD在觀察組不同臨床病理特征中的表達(dá)差別 觀察組中Galectin-3、MMP-14和MVD的表達(dá)與腫瘤體積、有無浸潤(rùn)、分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(均P＜0.01)。見表2。

表1 Galectin-3、MMP-14和MVD在觀察組與對(duì)照組中的表達(dá)

2.3 觀察組中Galectin-3、MMP-14和MVD表達(dá)的關(guān)系 經(jīng)線性相關(guān)分析顯示，觀察組中Galectin-3和MMP-14的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.41，P=0.042 3)，Galectin-3和MVD的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.45，P=0.031 4)，MMP-14和MVD的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.47，P=0.024 0)。

2.4 觀察組中Galectin-3、MMP-14和MVD的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 本組患者隨訪時(shí)間為7～60個(gè)月，平均28.7個(gè)月。Galectin-3、MMP-14和MVD陽(yáng)性組和陰性組生存曲線見圖1。膀胱尿路上皮癌中 Galectin-3(χ2=18.7728，P ＜0.05)、MMP-14(χ2=23.8157，P ＜0.05)和 MVD(χ2=24.7380，P ＜0.05)的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)(P＜0.05)，即Galectin-3、MMP-14和MVD高表達(dá)患者的預(yù)后差。

表2 Galectin-3、MMP-14和MVD在觀察組不同臨床病理特征中的表達(dá)差別

圖1 Galectin-3、MMP-14、MVD與膀胱癌患者生存的關(guān)系

3 討論

腫瘤形成及發(fā)展過程中的生物學(xué)行為受到人們的廣泛關(guān)注，而腫瘤轉(zhuǎn)移作為腫瘤發(fā)展中的重要因素，腫瘤中有血管新生，為其生長(zhǎng)及血道播散提供了直接證據(jù)。Galectin-3是動(dòng)物血凝素Lectin家族成員之一，因與含有β半乳糖苷殘基的糖復(fù)合物具有很高的親和力而得名〔4〕。Galectin-3的相對(duì)分子量約為31×103，編碼基因位于染色體1p13及14q21～22，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，因Galectin-3在結(jié)構(gòu)上缺乏轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列，因此這種結(jié)構(gòu)具有傳遞信號(hào)的作用。雖然Galectin-3有上述多種作用，但是有觀點(diǎn)認(rèn)為Galectin-3表達(dá)最主要的功能是參與細(xì)胞外黏附與基質(zhì)的反應(yīng)，其可能與MMPs有協(xié)同作用〔5，6〕。由于Galectin-3是一種糖化蛋白，需要通過在碳?xì)渥R(shí)別位點(diǎn)與其配體的糖苷結(jié)合后，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而發(fā)揮一系列生物學(xué)功能〔7〕。MMP家族是一組鋅離子依賴性內(nèi)切酶，與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和腫瘤的新生血管形成密切相關(guān)。MMP-14作為MMP家族的重要成員，能夠在細(xì)胞表面活化MMP-2等重要因子。而且有研究顯示MMP-14也與腫瘤的血管新生有密切關(guān)系〔6〕。膀胱癌的侵襲和轉(zhuǎn)移與基膜的黏附和細(xì)胞外基質(zhì)的降解有關(guān)。MMP-14是膀胱癌細(xì)胞中產(chǎn)生的重要物質(zhì)，作用于周圍的間質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生MMP-14原酶，該酶激活后被腫瘤細(xì)胞攝取到細(xì)胞膜表面。激活的MMP-14不僅可以激活MMP-2降解周圍的基質(zhì)，而且自身也可以發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用。而細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜是腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散的屏障，腫瘤細(xì)胞依靠MMP-14降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。CD34是特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，能成功標(biāo)記腫瘤中的新生血管。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膀胱尿路上皮癌中Galectin-3和MMP-14高表達(dá)，提示二者在膀胱尿路上皮癌的形成過程中起重要的促進(jìn)作用。膀胱尿路上皮癌中MVD高表達(dá)，提示腫瘤中存在著血管新生，這為腫瘤的生長(zhǎng)及血道播散提供了最便捷的條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Galectin-3和MMP-14均與腫瘤體積、浸潤(rùn)、分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示Galectin-3和MMP-14參與腫瘤的浸潤(rùn)、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。膀胱尿路上皮癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移常常表現(xiàn)出高度的組織特異性，并非隨意性，能轉(zhuǎn)移到特定器官的惡性腫瘤均具有多種機(jī)制促進(jìn)它們侵襲及繁殖。由于膀胱尿路上皮癌中Galectin-3、MMP-14和MVD之間均呈正相關(guān)性，提示其可能存在著通路的作用，即三種蛋白形成獨(dú)立的作用途徑，其作用機(jī)制可能為 Galectin-3作為上游蛋白，促進(jìn) MMP-14的表達(dá)〔8，9〕，進(jìn)而促進(jìn)MVD的高表達(dá)使新生血管形成，但是其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚需要更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)的生存分析顯示Galectin-3、MMP-14和MVD高表達(dá)患者的預(yù)后差，因此術(shù)后對(duì)膀胱尿路上皮癌進(jìn)行Galectin-3、MMP-14和CD34的免疫組化檢測(cè)，對(duì)判斷膀胱尿路上皮癌的預(yù)后及指導(dǎo)治療有重要價(jià)值。

綜上所述，膀胱尿路上皮癌中Galectin-3、MMP-14具有協(xié)同作用，參與腫瘤中CD34陽(yáng)性的血管生成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，術(shù)后聯(lián)合檢測(cè)三種蛋白對(duì)指導(dǎo)膀胱癌預(yù)后評(píng)估有重要意義。

1 Oka N，Nakahara S，Takenaka Y，et al.Galectin-3 inhibits tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis by activating Akt in human bladder carcinoma cells〔J〕.Cancer Res，2005;65(17):7546-53.

2 Kramer MW，Kuczyk MA，Hennenlotter J，et al.Decreased expression of galectin-3 predicts tumour recurrence in pTa bladder cancer〔J〕.Oncol Rep，2008;20(6):1403-8.

3 Chaffer CL，Dopheide B，McCulloch DR，et al.Upregulated MT1-MMP/TIMP-2 axis in the TSU-Pr1-B1/B2 model of metastatic progression in transitional cell carcinoma of the bladder〔J〕.Clin Exp Metastasis，2005;22(2):115-25.

4 Nangia-Makker P，Raz T，Tait L，et al.Galectin-3 cleavage:a novel surrogate marker for matrix metalloproteinase activity in growing breast cancers〔J〕.Cancer Res，2007;67(24):11760-8.

5 Kobayashi T，Shimura T，Yajima T，et al.Transient gene silencing of galectin-3 suppresses pancreatic cancer cell migration and invasion through degradation of β-catenin〔J〕.Int J Cancer，2011;129(12):2775-86.

6 廖紫瓊，朱潤(rùn)慶，張 鍇，等.Galectin-3與MMP-2在乳腺癌中的表達(dá)意義〔J〕.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007;28(2):166-76.

7 Nangia-Makker P，Balan V，Raz A.Regulation of tumor progression by extracellular galectin-3〔J〕.Cancer Microenviron，2008;1(1):43-51.

8 Kim SJ，Shin JY，Lee KD，et al.Galectin-3 facilitates cell motility in gastric cancer by up-regulating protease-activated receptor-1(PAR-1)and matrix metalloproteinase-1(MMP-1)〔J〕.PLoS One，2011;6(9):e25103.

9 McClung HM，Thomas SL，Osenkowski P，et al.SPARC upregulates MT1-MMP expression，MMP-2 activation，and the secretion and cleavage of galectin-3 in U87MG glioma cells〔J〕.Neurosci Lett，2007;419(2):172-7.