楊春媛

清熱消炎寧片具有清熱解毒，消炎止痛，舒筋活絡的功效。用于治療流行性感冒，咽喉炎，肺炎，菌痢，急性胃腸炎，闌尾炎，燒傷，瘡瘍膿腫，蜂窩織炎。其主要成分為九節(jié)茶。九節(jié)茶又名腫節(jié)風、草珊瑚等，是金粟蘭科植物接骨金粟蘭的枝葉。主要成份有香豆酮、黃酮甙、類脂、氰甙、揮發(fā)油和鞣酚等。主要藥理作用有抗菌、鎮(zhèn)痛、增強免疫功能、抗癌及促進骨折愈合等。本品還能促進細胞吞噬功能。其所含琥珀酸有鎮(zhèn)痛作用，能促進早期成骨細胞增生，加快骨斷端連接及骨髓腔再通，從而促進骨折愈合。腫節(jié)風還有抗癌、平喘及抗胃潰瘍等藥理作用。本品抗菌譜廣，對金黃色葡萄球菌、甲型鏈球菌、肺炎雙球菌、卡他球菌、流感桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等均有較強的抑制作用，其中的抑菌活性會干擾微生物限度檢查的準確度。

1 實驗用儀器和培養(yǎng)基

1.1 實驗用培養(yǎng)基 玫瑰紅鈉培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖增菌液、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基、pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液、0.9%氯化鈉溶液。(培養(yǎng)基生產單位：北京三藥科技開發(fā)公司)

1.2 實驗用儀器 臺州椒江YJA電動勻漿儀、上海博迅MJX-250B-Z型霉菌培養(yǎng)箱、上海博迅SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、上海JY2001型電子天平。

1.3 實驗用菌種 白色念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉菌［CMCC(F)98003］、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、大腸埃希菌［CMCC(B)44102］來源：中國生物制品檢定所。

2 清熱消炎寧片方法學驗證［1］

2.1 實驗菌液制備

2.1.1 黑曲霉菌液制備：將培養(yǎng)一周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加含0.05%(ml/ml)聚三梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液3 ml，將孢子洗脫。吸取孢子懸液約0.1 ml加入9 ml含0.05%(ml/ml)聚三梨酯80的生理鹽水溶液中，經過10倍稀釋至10-5至10-7稀釋級，取菌數(shù)濃度約為50至100cfu/ml的活菌備用。

2.1.2 白色念珠菌菌液制備：將經25℃培養(yǎng)24 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物，2白金耳加入9 ml生理鹽水溶液中，經過10倍稀釋到10-4至10-6稀釋級，取菌數(shù)濃度約為50至100cfu/ml的活菌備用。

2.1.3 三種細菌菌液制備：將經35℃培養(yǎng)24 h的枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)物2白金耳分別加入9 ml生理鹽水溶液中，經過10倍稀釋到10-4至10-6稀釋級，取菌數(shù)濃度約為50至100cfu/ml的活菌備用。

2.2 實驗用細菌、霉菌及酵母菌驗證方法

2.2.1 1比10的供試液制備方法：取約10 g本品放勻漿杯中，加入100 ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，以4000轉/min運行2 min，搖勻，即制成1比10的供試液。

2.3 各實驗菌的回收率測定

2.3.1 試驗組操作方法：精密量取供試液1 ml，按供試品對照組同法操作，并且同時每個平皿加入50至100cfu相應試驗菌夜1 ml，立即傾注對應的瓊脂培養(yǎng)基，混勻，等培養(yǎng)基凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h，觀察結果并計數(shù)。

2.3.2 供試品對照組操作方法：精密量取供試液1 ml，分別注入五個平皿中(每個平皿約加入0.2 ml供試液)；供試品本底的菌數(shù)測定結果見表1。

2.3.3 菌液組操作方法：精密量取5種菌各1 ml，分別注入平皿；立即傾注對應的瓊脂培養(yǎng)基，凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h，觀察結果并計菌數(shù)，測定結果見表1。

2.4 結果

表1 各實驗菌回收率測定結果

2.3.4 通過表1總結出：回收率實驗采用培養(yǎng)基稀釋法，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌三種細菌回收率均大于70%，由此得出可采用培養(yǎng)基稀釋法測定細菌數(shù)；采用常規(guī)法測定霉菌及酵母菌數(shù)。

3 清熱消炎寧片控制菌檢查方法學驗證［1］

3.1 實驗菌液制備：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌菌液稀釋步驟同上述1.3，用無菌生理鹽水溶液制成含10至100cfu/ml菌數(shù)的菌液。

3.2 實驗用菌種：金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，大腸埃希菌［CMCC(B)44102］來源：中國生物制品檢定所。

3.3 控制菌驗證方法

3.3.1 陰性對照操作方法：精密量取10 ml稀釋劑置增菌液中，按相應控制菌檢查法檢查。

3.3.2 陰性菌對照組操作方法：方法同試驗組，但驗證大腸埃希菌時的陰性對照菌是金黃色葡萄球菌。

3.3.3 試驗組操作方法：精密量取規(guī)定量供試液及試驗菌加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基增菌液中，并按相應控制菌檢查法進行檢查。

3.3.4 供試品組操作方法：精密量取1比10供試液10 ml置上述增菌液中，并按相應控制菌檢查法進行檢查。

表2 控制菌大腸埃希菌

4 由上表結果可以得出結論

陰性對照菌組未檢出陰性對照菌(金黃色葡萄球菌)，而試驗組檢出大腸埃希菌，因此可按常規(guī)方法檢查控制菌。

5 總結

經微生物限度檢查方法學驗證試驗，清熱消炎寧片微生物限度檢查中，可采用培養(yǎng)基稀釋法測定細菌數(shù)，采用常規(guī)法測定霉菌(酵母菌)數(shù)以及控制菌。

［1］ 《中華人民共和國藥典》中國醫(yī)藥科技出版社，2010年版二部，附錄ⅪJ，第107頁．