王 蓓

(江蘇省揚(yáng)州商務(wù)高等職業(yè)學(xué)校 烹飪系，江蘇 揚(yáng)州 225127)

研究表明，蓮藕汁的成分復(fù)雜，而且其種類和含量隨蓮藕品種、產(chǎn)地、氣候和加工方法等因素的變化而變化。迄今為止，在蓮藕的主要抗氧化活性成分的認(rèn)識上還存在一定的分歧。蓮藕類食品經(jīng)過榨汁、均質(zhì)、滅菌等一系列加工工藝和貯藏后，其中的活性物質(zhì)損耗很大。因此，如何最大限度地保留對人體有功能活性的有效成分，是提高蓮藕汁產(chǎn)品質(zhì)量、增加產(chǎn)品附加值的關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)以蓮藕為試材，測定了不同蓮藕品種果汁中主要活性成分的含量，并采用不同抗氧化體系對其抗氧化活性進(jìn)行綜合評價，分析其抗氧化活性與主要活性成分的相關(guān)性，以期為蓮藕加工及其綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)和實(shí)踐參考。

1 鮮蓮藕汁制備方法

選取4種鮮蓮藕，每個品種制備成約100 mL的蓮藕汁。具體方法為:洗凈，拭干，用家用榨汁器榨出藕汁，經(jīng)100目干凈紗布過濾盛于燒杯中，將榨汁后的藕渣放入潔凈紗布中，再將藕汁全部壓出，合并于燒杯中，攪勻，在－18℃保存待用。市售藕汁類飲料打開包裝后直接用于分析。

2 指標(biāo)測定方法

2．1 活性成分含量測定方法

2．1．1 總多酚含量測定［1］

在堿性溶液中，多酚類化合物可以將鎢鉬酸還原(W6+變?yōu)閃3+)生成藍(lán)色化合物，在760 nm處有最大吸收，顏色的深淺與多酚含量呈正相關(guān)。一般用沒食子酸(或焦性沒食子酸)作為參照標(biāo)準(zhǔn)，提取物中總多酚的含量以等同于沒食子酸(gallic acid equivalent)的量表示。

準(zhǔn)確稱取真空干燥至恒重的焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品44.3 mg，用水溶解定容至100 mL，分別取2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 和 20.0 mL 于 100 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度。再分別取上述不同濃度溶液1 mL加到10 mL比色管中，然后依次加入1 mL去離子水、0.5 mL已稀釋2倍的福林酚試液、1.5 mL 26.7%的Na2CO3溶液，用水定容至10 mL，室溫下反應(yīng)2 h，于760 nm下測定吸光值。以吸光值對標(biāo)樣含量作圖，得到典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取2 mL鮮藕汁于帶塞試管中，加5 mL含1.2 mol/L HCl的甲醇/(1+1)提取，旋渦振蕩1 min后于90℃處理3 h，每30 min旋渦振蕩一次。冷卻后用甲醇稀釋至10 mL，在4000×g下離心5 min后測定，方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。按下式計算結(jié)果:

式中:X為藕汁中總多酚含量，mg/100 mL;C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出或用回歸方程計算出的樣液中總多酚含量，mg/mL;V1為測定的取用樣液體積，mL;V2為取用樣液總體積，mL。

2．1．2 兒茶素、沒食子酸、咖啡酸、多巴、兒茶酚測定

精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)樣品100 mg，用甲醇溶解定容到10 mL的棕色容量瓶中，作為工作母液備用。分別準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL，用甲醇稀釋定容到50 mL的棕色容量瓶中，配制成10～100 mL/L的混標(biāo)準(zhǔn)液，用0.45 μm的濾膜過濾后，上機(jī)繪制五種酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取10 mL果汁，用10 mL乙醚萃取3次，有機(jī)相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(真空，＜35℃)濃縮至干濾。

高效液相色譜操作條件。

色譜柱:DiamonsilTM(鉆石)C18柱(5u250×4.6 mm);

流動相:A，甲醇 +乙酸+水(10∶2∶88);B，甲醇+乙酸+水(90∶2∶8);

流速:1.0 mL/min;

進(jìn)樣體積:20 μL;

檢測雙波長:280 nm和320 nm;

柱溫:30℃。

表1 HPLC法梯度洗脫程序

2．1．3 維生素C測定

精確稱取100 mg抗壞血酸，用0.1%草酸溶液定容至100 mL，作為工作母液備用。準(zhǔn)確吸取2.0、4.0、6.0、8.0 mL 母液稀釋至 25 mL，用 0.45 μm 濾膜過濾后，上機(jī)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1 mL藕汁加10 mL 0.1%的草酸稀釋，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后上機(jī)測定。

高效液相色譜操作條件。

色譜柱:DiamonsilTM(鉆石)C18柱(5u250×4.6 mm);

流動相:甲醇 ∶磷酸二氫鉀緩沖液 =75∶25(pH=4.0);

流速:1.0 mL/min;

進(jìn)樣體積:20 μL;

檢測波長:266 nm;

柱溫:25℃。

2．1．4 總類胡蘿卜素測定［2］

樣品通過石油醚一丙酮(1+0.5)混合溶液萃取，使之與非類胡蘿卜素成分分離，在451 nm波長下測定萃取溶液的吸光度，計算出樣品中總類胡蘿卜素的含量。取5 mL果汁于25 mL具塞試管中，加10 mL石油醚一丙酮(1+0.5)混合液，振蕩提取，將提取液(上層有機(jī)部分)過濾至100 mL三角瓶中，如此反復(fù)提取3～4次，直至樣品提取液無色，將幾次濾液從三角瓶轉(zhuǎn)移至250 mL梨形分液漏斗中，并用水洗滌石油醚層，出現(xiàn)乳化時，加飽和 NaCl 3～5 mL，劇烈振蕩，待液相分層后棄去下層水相，重復(fù)2～3次，將石油醚層定量轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用無水硫酸鈉過濾，以石油醚定容，搖勻，用1 cm比色皿以石油醚作空白，在451 nm處測定吸光值。按下式計算結(jié)果:

式中:X為果汁中總類胡蘿卜素含量(以β胡蘿卜素計)，mg/100 mL;E為樣品在451 nm處的吸光度;E1為1% β胡蘿卜素石油醚溶液在451 nm波長下的消光值，即2500;V1為樣品總類胡蘿卜素提取液體積，mL;V2為取用樣液總體積，mL。

2．2 抗氧化能力測定方法

于5 mL藕汁中加入25 mL 50%乙醇，旋渦振蕩1 min后，用超聲波處理10 min，過濾備用。

2．2．1 羥基(·OH)自由基清除率的測定方法［3］

Fenton反應(yīng)是生物體內(nèi)產(chǎn)生·OH的主要反應(yīng)，其反應(yīng)式可表示為:Fe2++H2O2→Fe3++OH－+·OH，用比色分析法測定Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生的·OH，其中鄰菲羅啉與Fe2+是該反應(yīng)中一種常用的氧化還原指示劑，其顏色變化可敏銳地反映溶液氧化還原狀態(tài)的改變，如果向反應(yīng)加入·OH的清除劑，則·OH減少，同時Fe2+增多，溶液顏色變紅，由此可推算·OH清除劑對·OH的清除效率。實(shí)驗(yàn)按下表分組，試劑從表左至表右依次加入試管:

表2 羥基(·OH)自由基清除率分組測定表

反應(yīng)在37℃恒溫水浴中進(jìn)行，準(zhǔn)確反應(yīng)1.5 h后，以AK為空白對照，迅速測定536 nm處的吸光值。按下式計算樣品對·OH的清除率:

2．2．2 對 DPPH·清除能力實(shí)驗(yàn)［4］

實(shí)驗(yàn)按表3分組，加入96孔微量滴定板的每孔中。

表3 DPPH·清除能力分組實(shí)驗(yàn)表

每個處理重復(fù)3次，震蕩搖勻后于室溫下放置30 min，用酶標(biāo)儀測定各孔在517 nm處的吸光值，A0為空白對照值，Ai為樣品值，Aj為本底值。按下式計算樣品對DPPH·的抑制率:

2．2．3 ABTS 法測定總抗氧化能力［5］

ABTS經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS·+，向其中加入被測物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，則會與ABTS·+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，然后在ABTS·+這種自由基的最大吸光波長下檢測吸光度的變化，與含Trolox的對照標(biāo)準(zhǔn)體系比較，換算出被測物質(zhì)總的抗氧化能力。將7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L K2S2O8溶液等體積混合，在室溫、避光的條件下靜置過夜，形成ABTS·+自由基儲備液，使用前用80%乙醇稀釋成工作液，使其在室溫下于414 nm波長下的吸光度為0.070±0.020。測定時在96孔微量滴定板的每孔中加入390 μL 的 ABTS·+工作液，再加入 10 μL 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或藕汁提取液，以400 μL的80%乙醇為空白，混合10 s，于16 min后讀取414 nm波長下的吸光度。使用的Trolox參照物標(biāo)準(zhǔn)系列為0.20 mmol/L、0.40 mmol/L、0.60 mmol/L、0.80 mmol/L 和1.00 mmol/L。將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或樣品提取液清除自由基的能力與Trolox清除自由基的能力相對比，確定其相對抗氧化活性，單位為TEAC，即1 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)清除自由基能力相當(dāng)于Trolox清除同等自由基能力的毫摩爾數(shù)，或是100 mL果汁清除自由基能力相當(dāng)于Trolox清除同等自由基能力的毫摩爾數(shù)。按下式計算樣品的TEAC值:

式中:TEAC為Trolox當(dāng)量值，mmol/L;ΔA為加入樣品提取液后反應(yīng)體系吸光度變化值;CTrolox為Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mmol/L;ΔATrolox為加入相同體積Trolox后從其標(biāo)準(zhǔn)變化曲線上查得的吸光度變化值;V為樣品提取液體積，mL;V0為取用樣液總體積，mL。

3 結(jié)果與分析

3．1 蓮藕品種對鮮藕汁抗氧化性的影響

3．1．1 品種對活性成分的影響

4個蓮藕品種中的VC、總多酚、總類胡蘿卜素含量見表4，兒茶素、沒食子酸、咖啡酸、多巴、兒茶酚含量見表5。從表4可以看出，VC的含量介于178.6～290.6 mg·L－1，目前尚未見到相關(guān)的數(shù)據(jù)。多酚類含量介于573.1～655.0 mg·L－1，此數(shù)據(jù)可能與實(shí)際測得值有些許差異，這與蓮藕品種、產(chǎn)地以及測定方法有關(guān)，各品種間這兩類活性成分的含量呈現(xiàn)一定差異，但差異不大。較前兩類活性成分而言，總類胡蘿卜素含量相對較低，介于5.47～7.25 mg·L－1。

表4 不同蓮藕品種果汁中VC、多酚、總類胡蘿卜素含量

表5 不同蓮藕品種果汁中兒茶素、沒食子酸、咖啡酸、多巴、兒茶酚含量

蓮藕中的多酚類主要是類黃酮和咖啡酸、綠原酸、p-羥基苯甲酸、沒食子酸等，這些物質(zhì)在各品種間的含量無過大差異。

3．1．2 品種對抗氧化能力的影響

3．1．2．1 4 個蓮藕品種的·OH 和 DPPH·清除能力及與各活性成分含量的關(guān)系

羥自由基(·OH)是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧物種，其反應(yīng)特點(diǎn)是無專一性，且反應(yīng)速率快，可以使非自由基反應(yīng)物變成自由基，由氧化應(yīng)激所造成的損害幾乎全部是由·OH中介的，被公認(rèn)是最活潑也是最具危害性的自由基。采用Fenton反應(yīng)比色法測定4個蓮藕品種對·OH的清除效果(見表6)。由表6可以看出，4個蓮藕品種對·OH的清除率介于37.60% ～58.62%，各品種間存在的差異不明顯，其中，以拿麻種清除能力最強(qiáng)，鄂蓮5號最弱。

表6 不同蓮藕品種清除自由基能力的比較

DPPH法因具有快速、簡單、靈敏、直接的優(yōu)點(diǎn)，在當(dāng)前被廣泛應(yīng)用來測定物質(zhì)總的抗氧化能力。從表6可以看出，各蓮藕品種都表現(xiàn)出較強(qiáng)清除DPPH·能力，清除率均在54%以上，比平均值58.16%略低些，這可能與品種及品種栽境、活性成分提取方法有關(guān)。各品種在清除DPPH·時未表現(xiàn)出顯著的差異性。

對·OH、DPPH·兩種自由基清除能力強(qiáng)的品種，VC和多酚類含量都相對較高(見表7)。通過分析相關(guān)統(tǒng)計結(jié)果可知，各品種對兩種自由基的清除能力與VC含量呈正相關(guān)(r=0.645，P=0.118;r=0.545，P=0.206)，與多酚含量也呈正相關(guān)(r=0.598，P=0.156;r=0.799，P=0.031)，與總類胡蘿卜素含量存在一定的正相關(guān)(r=0.620，P=0.137;r=0.755，P=0.050)，其中 DPPH·清除率與多酚含量和總類胡蘿卜素含量均達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，這些相關(guān)性從圖1中各線型趨勢也可明顯看出。另外，不同品種間VC和多酚類含量之間達(dá)到極顯著水平(r=0.919，P＜0.01)。為明確兩者之間在清除自由基時是否存在干擾，進(jìn)行了偏相關(guān)分析，結(jié)果見表8。對比表7和表8發(fā)現(xiàn)，VC和多酚類含量間存在的相關(guān)性在清除兩種自由基時表現(xiàn)出增效作用，這可能與兩類物質(zhì)在與自由基反應(yīng)時出現(xiàn)的某些關(guān)聯(lián)性反應(yīng)有一定關(guān)系。

表7 不同蓮藕品種對自由基清除能力與VC、多酚、總類胡蘿卜素含量的關(guān)系

表8 不同蓮藕品種對自由基清除能力與VC、多酚類含量的偏相關(guān)性

圖1 自由基清除率與VC含量的關(guān)系

圖2 自由基清除率與總類胡蘿卜素含量的關(guān)系

圖3 自由基清除率與多酚類含量的關(guān)系

3．1．2．2 4 個蓮藕品種的 TEAC 值及 VC、多酚類、總類胡蘿卜素的相對貢獻(xiàn)率

本節(jié)用ABTS/K2S2O8體系測定了反映TAA的TEAC值，進(jìn)行了相關(guān)分析，計算了各抗氧化活性成分對TAA的相對貢獻(xiàn)率。

首先測定了藕汁中存在的主要抗氧化活性成分的TEAC值，結(jié)果是:VC0.56 mmol/L，焦性沒食子酸3.09 mmol/L，總類胡蘿卜素0.59 mmol/L，并據(jù)此計算各成分對TAA的相對貢獻(xiàn)率，結(jié)果見表9。

總體而言，所測定的4個蓮藕品種的抗氧化活性都比較好，其中拿麻種相對最強(qiáng)，TEAC值達(dá)到6.09，其次是鄂蓮4號和鄂蓮5號，TEAC值分別是5.47和5.19;東河早藕最低，TEAC值為4.03。從表9可以看出，在所測定的4個蓮藕品種中，多酚類對總抗氧化活性的貢獻(xiàn)率最大，介于58.35% ～63.69%;VC的貢獻(xiàn)率次之，介于30.03% ～37.65%，為多酚類的一半;總類胡蘿卜素的貢獻(xiàn)率最低。

表9 不同蓮藕品種的TEAC值及各活性成分對TAA的相對貢獻(xiàn)率

表10列出了不同蓮藕品種的TEAC值與VC、多酚、總類胡蘿卜素含量的關(guān)系，其中TEAC值與VC含量達(dá)到顯著水平(r=0.868，P=0.011)，與多酚類含量達(dá)到極顯著水平(r=0.909，P=0.005)，與總類胡蘿卜素含量之間的相關(guān)性不明顯(P＞0.1)。由此可見，多酚類物質(zhì)可能是蓮藕品種中主導(dǎo)的抗氧化活性成分。

表10 不同蓮藕品種的TEAC值與VC、多酚、總類胡蘿卜素含量的關(guān)系

綜合比較4個蓮藕品種對·OH和DPPH·兩種自由基的清除能力及其TEAC值，發(fā)現(xiàn)拿麻種品種清除效果較好，TEAC值最高。

4 結(jié)論、創(chuàng)新與展望

4．1 結(jié)論

4個蓮藕品種果汁中Vc的含量介于178.6～290.6 mg·L－1，多酚類含量介于573.1 ～655.2 mg·L－1，總類胡蘿卜素含量介于5.47～7.25 mg·L－1，Vc與多酚這兩大類活性成分含量在品種間的差異較為明顯，均以拿麻種含量最高，總類胡蘿卜素含量在品種間的差異不明顯。

4個蓮藕品種對·OH的清除率介于37.60% ～58.62%，品種間存在顯著的差異性;對·DPPH的清除率均在50%以上，品種間未呈現(xiàn)顯著的差異性，拿麻種清除率相對較高。用ABTS/K2520體系測定的反映總抗氧化能力的TEAC值介于4.03～6.09，拿麻種最高，東河早藕最低。綜合比較表明，拿麻種品種總抗氧化能力最強(qiáng)。

統(tǒng)計分析表明，各品種對·OH和·DPPH兩種自由基的清除能力與Vc、多酚及總類胡蘿卜素含量之間存在正相關(guān)，其中與Vc的相關(guān)度達(dá)到顯著水平(r=0.868，P=0.011)，與多酚類的相關(guān)度達(dá)到極顯著水平(r=0.909，P=0.005)，而與總類胡蘿卜素則無顯著相關(guān)關(guān)系(P＞0.1)，這表明多酚類物質(zhì)可能是蓮藕品種中主導(dǎo)的抗氧化活性成分。

本研究從蓮藕抗氧化活性的角度出發(fā)，運(yùn)用快速、簡便、靈敏的ABTS檢測法，比較了不同蓮藕品種的總抗氧化能力，為提高果汁產(chǎn)品的質(zhì)量、增加產(chǎn)品的附加值提供了一定的理論依據(jù)。

4．2 創(chuàng)新與展望

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和人們健康意識的不斷提高，人們越來越重視天然抗氧化活性物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，蓮藕類具有較強(qiáng)的抗氧化活性，并借鑒前人的提取方法測定了多酚類、VC及胡蘿卜素類主要抗氧化活性成分。但由于提取方法的限制，可能還有一些活性物質(zhì)被遺漏?？梢钥紤]提純這些天然抗氧化成分和植物活性成分，并將其添加到食物中作為膳食補(bǔ)充劑，以滿足不同消費(fèi)者的需求。

［1］凌關(guān)庭．抗氧化食品與健康［M］．北京:氣象出版社，2004，1．

［2］韓雅珊．食品化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1996．

［3］Kurowska E M，Ph D，Borradaile N M．Hyplcholesterolemic effects of dietary citrus juices in rabbits［J］．Nutrition Research，2000，20(1):121 －122．

［4］彭長連，陳少薇，林植芳，等．用清除自由基DPPH法評價植物抗氧化能力［J］．生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27(6):658－661．

［5］韓光亮，李翠梅，Eduardo Cacace，等．改良的 ABTS+法及其在優(yōu)化抗氧化活性物質(zhì)提取中的應(yīng)用［J］．衛(wèi)生研究，2004，33(5):620 －622．