王 智，薛榮亮，趙紅霞，高 慧，魏 欣

(1 西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院，西安 710004;2 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)

腦缺血/再灌注會導(dǎo)致DNA 損傷，同時亦損傷了DNA 自身的修復(fù)功能，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡［1］。研究發(fā)現(xiàn)，DNA 修復(fù)蛋白在DNA 損傷與修復(fù)機制占重要地位，DNA 修復(fù)蛋白表達的減少，可造成DNA 修復(fù)功能的降低，使部分DNA 損傷后不能得到有效的修復(fù)，隨之發(fā)生細(xì)胞損傷甚至凋亡［2］。姜黃素是從中藥植物姜黃的根莖中分離出的一種植物多酚，近年研究表明，姜黃素可能通過抑制氧自由基的生成，緩解損傷區(qū)域的炎癥反應(yīng)以及抗水腫作用，減少了腦缺血/再灌注后的細(xì)胞損傷或凋亡，從而起到一定的腦保護作用［3］。同時有許多相關(guān)研究表明，姜黃素可以降低氧化應(yīng)激和抑制脂質(zhì)過氧化對細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷［4，5］。但是目前關(guān)于在全腦缺血/再灌注過程中姜黃素是否能減輕DNA 損傷和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡尚不很清楚，2011年9月～2013年3月本實驗建立大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型，研究了在姜黃素的干預(yù)下大鼠海馬DNA 修復(fù)蛋白APE/Ref-1表達與神經(jīng)元凋亡之間的關(guān)系，對姜黃素發(fā)揮腦保護作用的具體途徑和機制做了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料 選用雄性清潔級Sprague-Dawley 大鼠144 只，鼠齡10 周左右，體質(zhì)量(300±10)g。術(shù)前在恒濕恒溫環(huán)境下飼養(yǎng)1 周，手術(shù)前12 h 禁飲食。姜黃素(購自西安綠立生物工程技術(shù)有限公司)，TUNEL 檢測試劑盒(購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，SABC(兔IgG)-POD Kit 試劑盒(購自北京索萊寶生物科技有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、anti-APE/Ref-1 多功能DNA 修復(fù)酶抗體(均購自上海博耀生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 144 只大鼠隨機平均分為假手術(shù)組(SO組)、缺血/再灌注組(IR組)和姜黃素干預(yù)組(CU組)各48 只。每組根據(jù)再灌注后處死大鼠時間的不同再分為2、6、12、24、48、72 h 6個亞組，每亞組8 只。

1.2.2 建立模型和取材 采用四血管阻塞法［6］建立全腦缺血/再灌注大鼠模型。3組大鼠在麻醉后均仔細(xì)游離、暴露雙側(cè)頸總動脈及椎動脈，IR組和CU組大鼠首先用電凝凝斷雙側(cè)椎動脈，再用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈5 min，之后松開動脈夾以恢復(fù)腦供血流。SO組大鼠僅游離暴露椎動脈和頸總動脈，不做凝斷或夾閉。CU組動物在再灌注后即刻腹腔注射姜黃素溶液20 mg/kg，而SO組和IR組動物只腹腔注射相同量生理鹽水。3組大鼠分別于再灌注后2、6、12、24、48、72 h 6個時點處死，斷頭后取出完整大腦，仔細(xì)剝離蛛網(wǎng)膜及軟膜后，切取含有海馬頭端的腦組織，制備海馬冠狀石蠟切片。

1.2.3 TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡情況 將切片脫蠟至水后滴加蛋白酶K(25 mg/L)，37 ℃濕盒溫育15 min，PBS 洗5 min 共2 次，蒸餾水加3% H2O2，室溫下孵育10 min 以滅活內(nèi)源性酶，依次滴加末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶、生物素標(biāo)記的核苷混合物、鏈霉素蛋白辣根過氧化物酶溶液進行孵育，PBS 洗3 次后，DAB 顯色。鏡下控制反應(yīng)時間，一般在5 min 之內(nèi)，三蒸水洗滌。最后蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。在高倍鏡(40×10)下觀察，細(xì)胞核呈現(xiàn)深棕黃色者即為凋亡細(xì)胞。光鏡下觀察每張切片海馬CA1區(qū)，隨機選取5個視野，分別計算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。凋亡細(xì)胞率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 免疫組化SABC 法檢測APE/Ref-1 蛋白 將切片常規(guī)脫蠟至水;蒸餾水加3% H2O2室溫處理5～10 min 以滅活內(nèi)源性酶。熱修復(fù)抗原:將切片浸入0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)，電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5～10 min 后，反復(fù)1～2 次。滴加5% BSA 封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，免洗。滴加稀釋的一抗(1∶100的APE/Ref-1 多抗)37 ℃孵育1 h 左右。PBS(pH 7.2～7.4)洗滌3 次，每次2 min。擦干切片周圍水分后，滴加bio-羊抗兔IgG，20～37 ℃孵育30 min。PBS(pH 7.2～7.4)洗滌3 次，每次2 min。滴加鏈霉抗生物素蛋白—生物素—過氧化物酶復(fù)合物，孵育20 min。三蒸水洗5 min，3 次，DAB 顯色。鏡下控制反應(yīng)時間，一般在5 min 之內(nèi)三蒸水洗滌。蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡觀察，切片中顯示細(xì)胞質(zhì)黃染，有棕黃色顆粒者為APE/Ref-1 陽性細(xì)胞。定量分析:在高倍鏡(40×10)下觀察切片海馬CA1 區(qū)，隨機選取5個視野，分別計算陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.2 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以±s 表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t 檢驗［7］。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組不同時間細(xì)胞凋亡率比較 見表1。SO組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡較少見，而IR組于再灌注6 h 后凋亡的神經(jīng)元開始增多，并于48 h 時點細(xì)胞凋亡率達到最高。與SO組各相同時點比較，IR組細(xì)胞凋亡率增高(P 均＜0.01)。CU組于再灌注6 h 后的各時點神經(jīng)元細(xì)胞凋亡較IR組少(P 均＜0.01)。

表1 各組不同時點大鼠海馬CA1 區(qū)細(xì)胞凋亡率比較(%，±s)

表1 各組不同時點大鼠海馬CA1 區(qū)細(xì)胞凋亡率比較(%，±s)

注:與SO組比較，* P＜0.01;與IR組比較，#P＜0.01

2.2 各組APE/Ref-1 陽性細(xì)胞率比較 見表2。SO組APE/Ref-1 陽性細(xì)胞在各時點較多;IR組APE/Ref-1 陽性細(xì)胞率再灌注后2 h 開始出現(xiàn)明顯降低，一直持續(xù)至72 h，與SO組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P 均＜0.01);CU組APE/Ref-1 陽性細(xì)胞率降低不明顯，各時點與IR組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P 均＜0.01)。

表2 各組不同時點大鼠海馬CA1 區(qū)APE/Ref-1 陽性細(xì)胞率的比較(%，±s)

表2 各組不同時點大鼠海馬CA1 區(qū)APE/Ref-1 陽性細(xì)胞率的比較(%，±s)

注:與SO組相比，* P＜0.01;與IR組相比，#P＜0.01

3 討論

全腦缺血/再灌注損傷涉及細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸神經(jīng)毒性、線粒體功能障礙、氧自由基導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷等多種因素［8］。研究表明，腦缺血/再灌注損傷中的眾多因素(例如氧自由基)都可影響神經(jīng)元修復(fù)DNA 損傷的能力［9］。一旦DNA 損傷與修復(fù)異常，修復(fù)失敗的神經(jīng)元則發(fā)生凋亡，腦損傷則進一步加重［10］。

有研究報道，腦缺血/再灌注早期，自由基可引發(fā)多種形式DNA 損傷，其中就包括了DNA 非嘌呤非嘧啶(AP)位點的產(chǎn)生、堿基損傷、單鏈和雙鏈DNA 斷裂等［11］。APE/Ref-1 即無嘌呤/無嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子-1 基因，是參與哺乳動物DNA 修復(fù)的重要修復(fù)基因。APE/Ref-1 蛋白可通過識別與修復(fù)AP 位點和堿基損傷，發(fā)揮3'-磷酸二酯酶的作用，參與修復(fù)單鏈和雙鏈DNA 斷裂［12］。另外，腦缺血/再灌注后由活性氧引起的氧化性DNA損傷也是神經(jīng)元DNA 損傷的一個原因。此種損傷最常見的是AP 位點的產(chǎn)生和堿基序列的改變。APE/Ref-1 內(nèi)所含的能識別AP 位點的AP 核酸內(nèi)切酶正是活性氧自由基損傷修復(fù)過程中的限速酶，具有堿基切除修復(fù)功能，可針對此氧化損傷過程進行基因修復(fù)。此外，它又參與氧化還原反應(yīng)調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子(AP-1、核因子κB 等)的DNA 結(jié)合活性，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，參與神經(jīng)元DNA的修復(fù)，從而起到抗凋亡作用。

姜黃素是傳統(tǒng)中藥姜黃的主要有效成分，其具有多種生物學(xué)活性和藥理作用，減輕炎性反應(yīng)、抗自由基損傷等作用已得到證實［13，14］。姜黃素對氧自由基有清除作用，在全腦缺血/再灌注損傷后能顯著減少缺血區(qū)腦組織的脂質(zhì)過氧化物丙二醛，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，并能預(yù)防性對抗H2O2和超氧陰離子引起的氧化性損傷，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)對腦組織的損害，對缺血的腦組織具有保護作用［15］。石晶等［16］認(rèn)為，姜黃素可能通過提高體內(nèi)SOD 活性和清除自由基，維持線粒體的功能以及減輕細(xì)胞的能量代謝障礙，從而對腦組織具有良好的保護效應(yīng)。通過上述各種機制，姜黃素對大鼠全腦缺血/再灌注損傷后的細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用。

本研究中，與IR組比較，CU組大鼠缺血/再灌注后6 h 以及其后的各個時點凋亡率才有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，而2 h 時點則無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與姜黃素的藥物代謝動力學(xué)相關(guān)，與姜黃素的體內(nèi)血藥濃度曲線一致［17］。給予姜黃素腹腔注射后，從腦缺血/再灌注后2 h 時點開始，相比于IR組，CU組的APE/Ref-1 陽性細(xì)胞增多，并且一直持續(xù)至再灌注后72 h。與此同時，再灌注6 h 后的各時點細(xì)胞凋亡減少。表明在腦缺血/再灌注損傷發(fā)生后，姜黃素可能通過上調(diào)DNA 修復(fù)蛋白APE/Ref-1的表達，減緩細(xì)胞中DNA損傷的加重，抑制神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮對抗腦缺血/再灌注損傷的作用。

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