黃潔 蔣秀紅 新合力（蘇州）滅菌技術(shù)有限公司 (蘇州 215125)

0.前言

環(huán)氧乙烷（Ethylene Oxide, 簡寫為EO或EtO, ETO）是一種運(yùn)用廣泛的化學(xué)滅菌劑，對(duì)細(xì)菌、病毒、芽胞、真菌都有較強(qiáng)的滅菌作用，廣泛運(yùn)用于紙張、皮革、木材、金屬、塑料、化纖制品等滅菌。環(huán)氧乙烷于1859年由Charles Wurtz首次制備，上世紀(jì)60年代之前主要用做殺菌劑和熏蒸劑。上世紀(jì)60年代隨著一次性使用醫(yī)療器械的開發(fā)和投入使用，開始用于醫(yī)療器械滅菌。由于環(huán)氧乙烷具有低溫滅菌、滅菌范圍廣、穿透性強(qiáng)等特點(diǎn)，此后在醫(yī)療器械滅菌領(lǐng)域發(fā)展迅速。目前全球醫(yī)療器械的滅菌，大約一半的市場(chǎng)份額由環(huán)氧乙烷滅菌占據(jù)[1]。

本文簡述運(yùn)用環(huán)氧乙烷滅菌技術(shù)時(shí)，所需要考量的主要因素。

1.滅菌參數(shù)

環(huán)氧乙烷滅菌的基本原理是環(huán)氧乙烷做為強(qiáng) 烷化劑，與微生物的核酸、功能蛋白、酶等的氨基、羧基、羥基、巰基等基團(tuán)反應(yīng)，使之發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)上的改變（烷基化），從而影響其生物學(xué)活性，阻止微生物細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞死亡。做為化學(xué)反應(yīng)，滅菌的反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度、溫度等因素有關(guān)。以下對(duì)影響環(huán)氧乙烷滅菌效果的主要因素如溫度、濃度、濕度、滅菌時(shí)間等因素做簡要介紹。

1.1 滅菌溫度

由于環(huán)氧乙烷滅菌為化學(xué)反應(yīng)，其反應(yīng)速率與溫度相關(guān)，通常為定量討論，定義其溫度系數(shù)Q10（Temperature Coefficient）為溫度每升高10?C后，反應(yīng)速率除以原反應(yīng)速率的比值。Charles R. Phillips在1949年發(fā)現(xiàn)環(huán)氧乙烷滅菌過程中，Q10為2.74，即滅菌溫度升高10度，反應(yīng)速率為原來的2.74倍[2]。后續(xù)其他學(xué)者的研究表明，該結(jié)論可能過于簡單。Ernst和Schull之后測(cè)得的Q10為1.8，且其研究顯示，Q10隨濃度變化而變化，但永遠(yuǎn)大于等于1.8[3]。其他人也做了相似的研究，測(cè)得的數(shù)據(jù)都在1.8至2.74之間[4]。

這些研究為定量分析溫度對(duì)環(huán)氧乙烷滅菌的影響奠定基礎(chǔ)。在實(shí)際的滅菌過程中，常以1.8～2.74這一范圍的Q10值來估算調(diào)整滅菌溫度對(duì)滅菌效果的影響。進(jìn)一步簡化的估算方法是：溫度每提高10?C，滅菌效果加倍。

就環(huán)氧乙烷滅菌的工業(yè)運(yùn)用而言，并非溫度越高越好，一方面是考慮到產(chǎn)品對(duì)溫度的耐受性，另外過高溫度要求會(huì)增加滅菌設(shè)備成本上的投入，因此最常見的滅菌溫度為50?C左右。

1.2 環(huán)氧乙烷濃度

大體上環(huán)氧乙烷滅菌符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)，即隨著反應(yīng)濃度的增加，化學(xué)反應(yīng)速率呈線形提高。然而研究發(fā)現(xiàn)存在著一個(gè)濃度限度，當(dāng)環(huán)氧乙烷濃度大于此限度時(shí)，滅菌反應(yīng)服從零級(jí)動(dòng)力學(xué)，具體表現(xiàn)為：進(jìn)一步提高環(huán)氧乙烷濃度對(duì)反應(yīng)速率基本無影響。

Ernst和Schull的研究表明，在37?C以上、環(huán)氧乙烷濃度大于884mg/l時(shí)，環(huán)氧乙烷滅菌為零級(jí)反應(yīng)[3]。因此將此原理運(yùn)用于工業(yè)滅菌，通常做法是適當(dāng)增加環(huán)氧乙烷濃度，最常見的滅菌濃度為600mg/l左右，既不使反應(yīng)濃度過低影響滅菌效果，也不無謂提高濃度增加成本。

實(shí)際滅菌過程中，對(duì)于濃度的計(jì)算有如下兩種方法：

a) 重量法

式中：

W為注入的環(huán)氧乙烷重量；

V是滅菌柜體積（空柜體積）；

b) 理想氣體狀態(tài)方程法(Ideal Gas Law)。

對(duì)理想氣體狀態(tài)方程進(jìn)行轉(zhuǎn)換，可得到以下環(huán)氧乙烷氣體濃度計(jì)算公式：

式中：

K為純環(huán)氧乙烷氣體的常數(shù)，其值為4.4×104；

P為EO注入過程的壓力差；

R為氣體常數(shù)，其值為0.08314；

T為滅菌柜溫度（開式溫度）。

以上兩種計(jì)算方法跟實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)均有差異，尤其是重量法，多數(shù)情況下差異更大。因此有條件的話可在滅菌柜內(nèi)安裝可實(shí)時(shí)監(jiān)控EO濃度的傳感器，能獲得準(zhǔn)確的實(shí)際濃度數(shù)據(jù)，且能得出EO濃度隨滅菌時(shí)間變化的關(guān)系，合理設(shè)計(jì)滅菌過程。

1.3 滅菌時(shí)間

滅菌過程作為微生物消亡的過程，符合指數(shù)規(guī)律，即滅菌過程中，微生物數(shù)量的對(duì)數(shù)值與滅菌時(shí)間呈線形相關(guān)。目前確定滅菌時(shí)間的最常見方法是過度殺滅法中的半周期法(Half-cycle Approach)[6～7]。即以能使生物指示劑（BI）/工藝調(diào)整器械（PCD）全部殺滅的滅菌周期為基礎(chǔ)，將其定為半周期。三次半周期均取得滿意結(jié)果后，將滅菌時(shí)間至少延長一倍，得到全周期。

其理論基礎(chǔ)為：半周期中由于BI的生物負(fù)載大于106, 當(dāng)BI全部殺滅時(shí)，其對(duì)數(shù)下降值（Spore Log Reduction, SLR）≥6，生物負(fù)載由106降至100以下；當(dāng)滅菌時(shí)間加倍后（全周期），生物負(fù)載進(jìn)一步由100降至10-6（實(shí)際上由于沒有活菌，此時(shí)并無存活微生物，只有微生物存活的幾率）。這樣即達(dá)到醫(yī)療器械通常意義上的無菌（無菌保證水平Sterility Assurance Level達(dá)到10-6）。

除了半周期法之外，ISO 11135-1:2007也列出了其他允許的方法如BI/生物負(fù)載法（Biological Indicator/Bioburden Approach）等，詳情可參見ISO 11135-1:2007的附錄A、附錄B以及ISO/TS 11135-2:2008的附錄A、附錄B。

1.4 濕度

濕度在環(huán)氧乙烷滅菌過程中起重要作用，通常認(rèn)為濕度的作用有兩方面，一方面，環(huán)氧乙烷與脫水的細(xì)菌芽胞反應(yīng)需要有一定的水分；另一方面，水能增強(qiáng)環(huán)氧乙烷的穿透性，使之更容易透過醫(yī)療器械的包裝。

濕度有露點(diǎn)、相對(duì)濕度等表示方法，通常環(huán)氧乙烷滅菌中采用相對(duì)濕度。實(shí)驗(yàn)室中的研究表明30%以上的相對(duì)濕度對(duì)滅菌過程即已充分，但考慮到工業(yè)滅菌中，穿透到產(chǎn)品包裝（如初包裝、立方袋、中盒、大箱、托盤纏繞膜）內(nèi)的相對(duì)濕度會(huì)有損失，工業(yè)上通常采用60%左右的相對(duì)濕度對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行處理。

在滅菌柜內(nèi)沒有裝濕度傳感器的情況下，可用以下公式計(jì)算滅菌柜內(nèi)的相對(duì)濕度：

式中：

Pw為注入的蒸氣分壓；

Pi為蒸氣注入前滅菌柜內(nèi)的蒸氣分壓；

Pss為滅菌溫度下的飽和蒸汽壓。

通過上述公式計(jì)算出的相對(duì)濕度是一個(gè)理論值，跟實(shí)際的滅菌濕度有時(shí)會(huì)有較大差異。

由上述1.1及1.4部分可以看出，環(huán)氧乙烷滅菌過程中，產(chǎn)品溫度和濕度能顯著影響滅菌效果。而產(chǎn)品溫度和濕度受季節(jié)因素影響，特別是在冬季，由于溫度較低、空氣干燥，對(duì)產(chǎn)品滅菌尤為不利。因此工業(yè)化環(huán)氧乙烷滅菌大多設(shè)有預(yù)處理（Preconditioning）這一工藝過程。通過將產(chǎn)品置于預(yù)處理室中，對(duì)其升溫加濕，使產(chǎn)品在進(jìn)入滅菌柜前即達(dá)到較理想的溫濕度水平。如此可使滅菌時(shí)間縮短，提高滅菌效率。

2.產(chǎn)品放行與生物指示劑

環(huán)氧乙烷滅菌產(chǎn)品的放行方式主要有兩種：傳統(tǒng)放行和參數(shù)放行，這兩種產(chǎn)品放行方式的滅菌確認(rèn)中都需要用到生物指示劑（Biological Indicator, BI）, 以下對(duì)這兩種放行方式及生物指示劑做簡單介紹。

2.1 傳統(tǒng)放行 (Conventional Release)

傳統(tǒng)放行是結(jié)合滅菌參數(shù)審核和BI檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)品放行的方式，這是目前國內(nèi)外采取的最主要方式，為各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)所接受。環(huán)氧乙烷滅菌的工藝參數(shù)非常之多，當(dāng)出現(xiàn)輕微、不影響滅菌效果工藝偏差時(shí)，BI檢測(cè)結(jié)果能為是否放行產(chǎn)品提供微生物學(xué)依據(jù)。

傳統(tǒng)放行的缺點(diǎn)是BI培養(yǎng)需要7天，可能會(huì)延長產(chǎn)品周轉(zhuǎn)時(shí)間，另外BI本身及其檢測(cè)也需要一定的成本或者產(chǎn)生部分費(fèi)用。

在滅菌確認(rèn)方面，ISO 11135-1:2007規(guī)定需要定期進(jìn)行再確認(rèn)，但對(duì)于“定期”的頻率并未做硬性規(guī)定，ISO/TS 11135-2:2008建議至少每兩年進(jìn)行一次再確認(rèn)。

2.2 參數(shù)放行 (Parametric Release)

參數(shù)放行是指基于滅菌參數(shù)審核進(jìn)行產(chǎn)品放行的方式，由于免除了BI檢測(cè)，具有產(chǎn)品周轉(zhuǎn)快、放行成本低等優(yōu)勢(shì)。但是由于缺乏BI檢測(cè)結(jié)果這一微生物學(xué)支持，當(dāng)出現(xiàn)滅菌工藝偏差時(shí)，滅菌批被拒收的概率隨之加大。如果是不能重復(fù)滅菌的產(chǎn)品，其質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)非常之高，所以通常采用參數(shù)放行的產(chǎn)品，至少能經(jīng)受兩次環(huán)氧乙烷滅菌而不影響產(chǎn)品性能或包裝，且重復(fù)滅菌后的殘留水平亦能符合限度標(biāo)準(zhǔn)。

參數(shù)放行對(duì)滅菌設(shè)備提出了更高的要求，與一般設(shè)備相比，還需要：

a) 滅菌柜中有兩個(gè)在不同位點(diǎn)安裝的溫度傳感器；b) 滅菌柜中有能直接讀取相對(duì)濕度的傳感器；c) 滅菌柜中有能直接讀取環(huán)氧乙烷濃度的傳感器。

在滅菌確認(rèn)方面，ISO 11135-1:2007規(guī)定參數(shù)放行的再確認(rèn)必須每年進(jìn)行一次。

另外特別需要指出的是，并非所有醫(yī)療器械的監(jiān)管機(jī)構(gòu)都認(rèn)可參數(shù)放行這一產(chǎn)品放行方式，例如我國醫(yī)療器械監(jiān)管機(jī)構(gòu)還未接受參數(shù)放行。

2.3 生物指示劑（BI）

生物指示劑（BI）是環(huán)氧乙烷滅菌的必需品。即使是無需進(jìn)行BI檢測(cè)的參數(shù)放行，其初始滅菌確認(rèn)和年度再確認(rèn)也需要采用BI，以證明達(dá)到所需的無菌保證水平（SAL）。

環(huán)氧乙烷滅菌中所用的BI，一般為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）或證明有同等抗性的其他菌株，孢子計(jì)數(shù)不得低于106，抗性要求為54?C條件下D值≥2.5min，和/或30?C條件下D值≥ 12.5min[8～9]。ISO 11138-1:2006和 ISO 11138-2:2009對(duì)環(huán)氧乙烷滅菌中所用的BI有較為詳細(xì)的規(guī)定。

滅菌后，BI的培養(yǎng)時(shí)間通常為7天，對(duì)于某些產(chǎn)品而言，這一時(shí)間可能過長，影響產(chǎn)品放行。縮短培養(yǎng)時(shí)間可以通過RIT （Reduced Incubation Time）研究來確認(rèn)，具體方法為：將100個(gè)BI經(jīng)亞致死周期滅菌，之后比較1～7天的陽性率，以第7天陽性率為基準(zhǔn)，達(dá)到其97%水平的天數(shù)即為經(jīng)確認(rèn)的培養(yǎng)天數(shù)。使用該方法時(shí)FDA有許多建議的要點(diǎn)，如：

a) 亞致死周期中，陽性率應(yīng)在30%～80%之間；

b) 至少3個(gè)亞致死周期；

c) BI至少3個(gè)批號(hào)，每個(gè)批號(hào)至少100個(gè)；

d) BI取出后8h內(nèi)必須測(cè)試；

e) BI培養(yǎng)時(shí)間至少為7天。

3.環(huán)氧乙烷殘留量

環(huán)氧乙烷通常被認(rèn)為是一種低殘留量的滅菌劑，但其在某些產(chǎn)品上可能在滅菌后有一定量的殘留EO（環(huán)氧乙烷）、ECH（2-氯乙醇）以及EG（乙二醇）。

ISO 10993-7:2008 是目前國際上常用的規(guī)定環(huán)氧乙烷殘留量限度的主要標(biāo)準(zhǔn)，ISO 10993-7:2008指出：當(dāng)EO和ECH均符合限度時(shí)，EG的風(fēng)險(xiǎn)較小[10]。因此目前主要檢測(cè)EO和ECH兩種殘留物質(zhì)。

對(duì)于在我國市場(chǎng)銷售的產(chǎn)品，我國GB15980-1995 規(guī)定EO限度不得超過10μg/g[11]，因此內(nèi)銷的一次性使用醫(yī)療用品需要符合這一限度標(biāo)準(zhǔn)。

降低EO以及ECH、EG殘留量的主要工藝方法是通風(fēng)，含常溫通風(fēng)和強(qiáng)制通風(fēng)兩種。由于常溫通風(fēng)受季節(jié)因素影響大，目前國際上的主流方法是強(qiáng)制通風(fēng)。即在維持一定的溫度和換氣次數(shù)的情況下通風(fēng)。單位時(shí)間內(nèi)的換氣次數(shù)越多，解析溫度越高，通風(fēng)效果也越好。

ISO 10993-7:2008指出，對(duì)大多數(shù)產(chǎn)品而言，產(chǎn)品中的EO殘留量的對(duì)數(shù)值，與產(chǎn)品的通風(fēng)時(shí)間呈線形相關(guān)。該方法可用來建立EO釋放曲線，計(jì)算EO殘留量達(dá)標(biāo)所需的通風(fēng)時(shí)間。

4.產(chǎn)品設(shè)計(jì)

采用環(huán)氧乙烷滅菌的醫(yī)療器械，在產(chǎn)品設(shè)計(jì)和確認(rèn)階段即應(yīng)充分考慮滅菌因素。第一，產(chǎn)品包裝應(yīng)為透氣包裝，原因是：a) 有利于EO、水蒸氣、熱量等穿透至滅菌部位；

b) 有利于滅菌殘留物（EO、ECH、EG）快速從產(chǎn)品中逸出；

c) 有利于包裝和產(chǎn)品完整，比如透氣性不充分的包裝可能會(huì)在壓力變化下爆裂開口。

第二，產(chǎn)品的組成材料應(yīng)能經(jīng)受環(huán)氧乙烷滅菌，且不易吸附大量的滅菌殘留物。

第三，產(chǎn)品的構(gòu)造、折疊方式等等應(yīng)有利于氣體流通，如果產(chǎn)品內(nèi)部有閉合區(qū)，滅菌難度會(huì)大大增加。

第四，產(chǎn)品裝載模式應(yīng)有利于滅菌劑穿透，經(jīng)確認(rèn)的裝載模式應(yīng)予以規(guī)定，不能隨意更改。如果產(chǎn)品是堆載在托盤上，帶著纏繞膜滅菌，則纏繞膜的形式也應(yīng)經(jīng)過確認(rèn)，不得隨意更改。

第五，產(chǎn)品的材料、生產(chǎn)包裝工藝等應(yīng)有利于將產(chǎn)品初始污染菌控制在較低的水平，內(nèi)銷產(chǎn)品應(yīng)符合GB15980-1995中關(guān)于初始污染菌的相關(guān)要求。

另外，一般建議在產(chǎn)品設(shè)計(jì)和確認(rèn)階段，即考慮將來常規(guī)滅菌中偶爾失敗，需要將產(chǎn)品重新滅菌的可能性。由于重復(fù)滅菌可能會(huì)帶來更高的殘留物水平、對(duì)產(chǎn)品性能和包裝影響更大，為確認(rèn)重復(fù)滅菌的可行性，通常將產(chǎn)品經(jīng)過兩次或多次全周期滅菌，然后檢測(cè)產(chǎn)品性能、包裝性能、滅菌殘留物水平，確定允許的滅菌次數(shù)。

5.結(jié)語

綜上所述，運(yùn)用環(huán)氧乙烷對(duì)醫(yī)療器械滅菌需要考慮到滅菌參數(shù)、滅菌殘留、產(chǎn)品設(shè)計(jì)等諸多因素，較其他滅菌方式如輻照等更為復(fù)雜。自上世紀(jì)中期以來，大量的實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)應(yīng)用，使得醫(yī)療器械的環(huán)氧乙烷滅菌日趨成熟和完善，成為全球范圍的主流滅菌方式之一。本文對(duì)該領(lǐng)域的理論基礎(chǔ)和實(shí)際運(yùn)用做了一個(gè)簡要的歸納，希望能對(duì)感興趣的讀者有所幫助。

[1]新合力集團(tuán)內(nèi)部培訓(xùn)材料

[2]Charles R. Phillips, The sterilization action of gaseous ethylene oxide, II. Sterilization of contaminated objects with ethylene oxide and related compounds: time, concentration and temperature relationships, Am. J. Hyg., 1949, Vol 50: pp.280-288.

[3]Robert R. Ernst and James J. Shull, Ethylene oxide gaseous sterilization, I. Concentration and temperature effects, Appl Microbiol. 1962 July; 10(4): 337-341

[4]Gisela C. C. Mendes, Teresa R. S. Brand?o, and Cristina L. M. Silva, Etheylene oxide sterilization of medical devices: A review, Am J Infect Control. 2007 Nov; 35(9):574-81

[5]AAMI TIR15:2009 Physical aspects of ethylene oxide sterilization

[6]ISO 11135-1:2007 Sterilization of health care products – Ethylene oxide – Part 1: Requirements for development, validation and routine control of a sterilization process for medical devices

[7]ISO/TS 11135-2:2008 Sterilization of health care products – Ethylene oxide – Part 2: Guidance on the application of ISO 11135-1

[8]ISO 11138-1:2006 Sterilization of health care products – Biological indicators – Part 1: General requirements

[9]ISO 11138-2:2009 Sterilization of health care products – Biological indicators – Part 2: Biological indicators for ethylene oxide sterilization processes

[10]ISO 10993-7:2008 Biological evaluation of medical devices – Part 7: Ethylene oxide sterilization residuals

[11]GB15980-1995 一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)