林冬融 韓江全 胡泳濤 (遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 珠海 519100)

研究表明，高血糖是非糖尿病急性卒中患者高發(fā)病率和高死亡率的重要獨立危險因素，同時也可能是導(dǎo)致局部或廣泛缺血后預(yù)后更差的危險因素〔1～3〕。細胞色素C(Cyt-C)作為一個普遍的線粒體起源的細胞死亡信號〔4〕，在細胞凋亡過程中起著重要的作用。但高血糖是否影響線粒體的凋亡相關(guān)途徑，目前尚未明了。本實驗檢測高血糖條件下大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)功能評分及Cyt-C的表達，探討高血糖加重腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性SD大鼠70只(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)中心實驗室提供)，8～9周齡，體重250～300 g，隨機分為三大組:高血糖組30只、正常血糖組30只、假手術(shù)組10只。前兩組再隨機按腦缺血2 h再灌注后6、12、24 h分為三個亞組，每組10只。

1.2 方法

1.2.1 高血糖大鼠模型的制備 大鼠實驗前禁食12 h，自由進水。高血糖組于造模前30 min尾靜脈注射25%葡萄糖4 g/kg，造成高血糖狀態(tài)。正常血糖組則以同樣方法注射等量18%D-甘露醇。用血糖儀在栓線前測定血糖值。

1.2.2 腦缺血再灌注模型的制備 實驗大鼠以戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，采用改良Longa線栓法建立大腦中動脈阻塞再灌注模型。所有實驗大鼠均栓塞右側(cè)大腦中動脈(MCA)。栓塞2 h拔出栓線，分別于再灌注后6、12、24 h(每個亞組10只)處死。假手術(shù)組僅做頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈，縫合皮膚。模型成功的標志是動物蘇醒后出現(xiàn)同側(cè)的Horner征(眼裂變小，眼球內(nèi)陷)和對側(cè)以前肢為重的偏癱。

1.2.3 神經(jīng)功能評分 參照Zea-Longa5級4分制評分標準，分別于各時間點對實驗大鼠進行神經(jīng)功能評分:0分:無神經(jīng)功能缺失癥狀;1分:輕度局灶性神經(jīng)功能缺失(大鼠被提尾懸空時病灶對側(cè)前肢呈屈曲、抬高、肩內(nèi)收、肘關(guān)節(jié)伸直);2分:中度局灶性神經(jīng)功能缺失(有向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)征象);3分:重度局灶性神經(jīng)功能缺失(有向病灶對側(cè)跌倒征象);4分:無自發(fā)活動及意識水平下降。

1.2.4 細胞凋亡檢測 采用TUNEL法，嚴格按照試劑盒(武漢博士德公司)說明書進行。顯微鏡下在缺血半暗帶區(qū)取5個高倍視野，計算陽性細胞數(shù)(鏡下細胞核內(nèi)有棕黃色顆粒)。

1.2.5 免疫組化檢測Cyt-C表達 采用SABC法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后進行擴原修復(fù)。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，滴加正常非免疫動物血清封閉?？贵w稀釋液1∶100稀釋Ⅰ抗(Cytochrome C Rabbit mAb，購自武漢博士德生物工程有限公司)。滴加Ⅰ抗，4℃孵育過夜，次日室溫復(fù)溫30 min，移去Ⅰ抗，以0.01 mol/L PBS沖洗，滴加生物素化的羊抗兔IgG，室溫孵育10 min，PBS洗。滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，PBS洗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，返藍。脫水透明封片，顯微鏡觀察，陽性細胞胞質(zhì)呈棕黃色。在每張切片皮質(zhì)區(qū)隨機取不相重復(fù)的5個視野，數(shù)碼相機拍照，MiVnT顯微生物圖像分析系統(tǒng)對所拍圖象進行分析，統(tǒng)一光飽和度、亮度和色調(diào)，取平均灰度級算術(shù)均數(shù)用于各組間比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件分析系統(tǒng)處理，以±s表示，采用單因素方差分析檢驗。

2 結(jié)果

2.1 造模前血糖值 高血糖組血糖(16.48±1.88)mmol/L水平明顯高于正常血糖組(5.91±0.34)mmol/L(P＜0.01)。

2.2 神經(jīng)功能評分 假手術(shù)組全部動物均為0分，未見神經(jīng)功能缺損;其余兩組在大鼠麻醉清醒后即出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損。正常血糖缺血再灌注組與假手術(shù)組比較，神經(jīng)功能缺損程度明顯加重(P＜0.01);高血糖組與正常血糖組比較，神經(jīng)功能缺損加重(P＜0.05)。見表1。

2.3 TUNEL染色及光鏡下凋亡細胞計數(shù) 光鏡下假手術(shù)組可見少量凋亡細胞(0.50±0.53，細胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒)。正常血糖組再灌注6 h可見凋亡細胞，12 h逐漸增高，于再灌注24 h達高峰。高血糖組于再灌注6、12、24 h凋亡細胞計數(shù)多于相同時間段內(nèi)正常血糖組(P＜0.05)。見表2，圖1。

2.4 Cyt-C免疫組織化學(xué)染色 假手術(shù)組未見Cyt-C表達(151.33±3.22);正常血糖組再灌注6 h可見Cyt-C表達，12 h逐漸增高，于再灌注24 h達高峰;高血糖組于再灌注6、12、24 h Cyt-C表達明顯高于正常血糖組相應(yīng)各亞組。見表3，圖2。

表1 神經(jīng)功能評分比較(±s，n=10)

表1 神經(jīng)功能評分比較(±s，n=10)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與相同時間點正常血糖組比較:2)P＜0.01，3)P ＜0.05，下表同

組別 正常血糖組 高血糖組再灌注6 h 1.40±0.521) 2.20±0.631)2)再灌注12 h 2.60±0.521) 3.50±0.711)2)再灌注24 h 3.30±0.481) 3.80±0.421)2)

表2 凋亡細胞計數(shù)比較(±s，n=10)

表2 凋亡細胞計數(shù)比較(±s，n=10)

組別 正常血糖組 高血糖組再灌注6 h 11.40±1.511) 12.80±1.141)3)再灌注12 h 15.40±1351) 18.80±1.481)2)再灌注24 h 17.50±1.081) 19.10±0.991)2)

表3 Cyt-C免疫組化灰度級比較(±s，n=10)

表3 Cyt-C免疫組化灰度級比較(±s，n=10)

組別 正常血糖組 高血糖組再灌注6 h 117.40±1.501) 114.30±1.341)2)再灌注12 h 115.30±1.641) 109.00±1.561)2)再灌注24 h 113.10±1.521) 106.70±1.771)2)

圖2 各組腦缺血半暗帶皮質(zhì)區(qū)Cyt-C免疫組織化學(xué)染色(IHC，×400)

3 討論

腦缺血的發(fā)病機制，涉及能量代謝障礙、局部酸中毒、炎癥介質(zhì)釋放、自由基損傷、細胞內(nèi)Ca2+超載、興奮性氨基酸的毒性作用等。近年來研究〔5，6〕表明，神經(jīng)細胞凋亡在腦缺血神經(jīng)細胞損害中發(fā)揮重要作用。急性缺血性腦損傷發(fā)生后，梗死的周邊部位即半暗帶區(qū)的神經(jīng)元損傷主要通過凋亡途徑進行，凋亡神經(jīng)元的多少決定著缺血引起的損害最終范圍大小，細胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的主要環(huán)節(jié)，而線粒體則是細胞凋亡過程中重要的細胞器〔7〕。線粒體是通過向胞漿釋放Cyt-C等途徑參與各種凋亡過程，尤其是Cyt-C從線粒體向細胞漿的重新分布，這與各因素誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生有密切的關(guān)系。

高血糖既是缺血性腦血管病的危險因素之一，也是缺血區(qū)神經(jīng)元損傷加重的因素。高血糖加重腦缺血損傷的機制是多途徑、多水平的，包括有高血糖缺血腦組織中乳酸聚集，加重細胞內(nèi)酸中毒，對缺血部位神經(jīng)元產(chǎn)生直接毒性;高血糖促進興奮性氨基酸堆積;高血糖增強一氧化氮(NO)毒性作用;高血糖破壞血腦屏障，并促進梗死出血等，血管損傷和乳酸堆積酸中毒是最基本的途徑。本實驗結(jié)果顯示，Cyt-C的表達強度與凋亡細胞的數(shù)目存在一定關(guān)系。Cyt-C是一種可溶蛋白，正常時位于線粒體膜內(nèi)并松散地附著于線粒體膜的內(nèi)表面，當Cyt-C從細胞線粒體轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，則可通過免疫組織化學(xué)方法檢測到。釋放到細胞質(zhì)中的Cyt-C通過結(jié)合凋亡蛋白酶激活因子-1和caspase-9后，再激活caspase-3，這是導(dǎo)致細胞凋亡產(chǎn)生的中心事件〔8〕。以上結(jié)果表明通過線粒體通路加重細胞凋亡過程，是高血糖加重腦缺血損傷的機制之一。

1 Kostulas N，Markaki I，Cansu H，et al.Hyperglycaemia in acute ischaemic stroke is associated with an increased 5-year mortality〔J〕.Age Ageing，2009;38(5):590-4.

2 Harada S，F(xiàn)ujita WH，Shichi K，et al.The development of glucose intolerance after focal cerebral ischemia participates in subsequent neuronal damage〔J〕.Brain Res，2009;7(1279):174-81.

3 Bruno A.Management of hyperglycemia during acute stroke〔J〕.Curr Cardiol Rep，2009;11(1):36-41.

4 Kelvin Cain，Bratton SB，Cohen GM.The Apaf-1 apoptosome:a large caspase-activating complex〔J〕.Biochimie，2002;9(2-3):203.

5 韓江全，李 均，李官成，等.葛根素對大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)神經(jīng)元凋亡及膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)生長因子的影響〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009;31(19):1912-3.

6 Nijboer CH，Heijnen CJ，Groenendaal F，et al.A dual Role of the NF-{kappa}B pathway in neonatal hypoxic ischemic brain damage〔J〕.Stroke，2008;39(9):2578-86.

7 Hong SJ，Dawson TM，Dawson VL.Nuclear and mitochondral conversations in cell death:PARP-l and AIF signaling〔J〕.J Trends Pharmacol Sci，2004;25(5):259-64.

8 Suzuki A，Tsutomi Y，Yamamato N，et al.Mitochondrial regulation of cell death:mitochondria are essential for procase-3 p21 complex formation to resist Fas mediated cell death〔J〕.Mol Cell Biol，1999;19(9):3842.