楊麗珍,趙渺凡

(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 兒科,黑龍江 哈爾濱 150040)

性早熟是一種生長發(fā)育異常,主要表現為第二性征提早出現。近年來隨著我國人民生活水平的提高,隨意給健康兒童進補的現象十分普遍,據不完全隨意抽樣調查統計,約0.67%兒童發(fā)育提前,有性早熟的趨勢,約20%出現異常超重[1],其中以真性性早熟(亦稱特發(fā)性中樞性性早熟ICPP)最為常見,約占女孩性早熟的80%～90%,男孩性早熟的40%[2-3]。該癥主要由于下丘腦的神經內分泌功能失調致下丘腦—垂體—性腺軸(HPGA 軸)提前發(fā)動、功能亢進,導致第二性征提前出現、骨齡提前、骨骺過早閉合,兒童生長發(fā)育主要受生長激素-胰島素樣生長因子-I(GH-IGF-1)軸調控,而激素水平的提高導致性發(fā)育過早,也對患兒的心理發(fā)育產生不利影響。本實驗通過對中藥梔早顆粒對性早熟SD 大鼠干預機制的研究,觀察對血清GH、IGF-I 水平的影響情況,為中醫(yī)藥治療性早熟作用機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 SD 大鼠性早熟模型的建立

1.1.1 材料

1.1.1.1 喂養(yǎng)條件 1)選用SD 清潔級未孕大鼠,雌雄鼠20 對,體質量250～300 g(黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供),飼養(yǎng)于開放系統實驗室。2)溫度范圍19～29℃,濕度40%～80%,照明時間8:00-17:00,通風系統保持室內空氣流暢。3)每星期早上定時換2 次墊料,早上定時換水和加飼料,水為一般的自來水,普通飼料,動物自飲自食。

1.1.1.2 藥品試劑 達那唑膠囊(江蘇聯環(huán)藥業(yè)股份有限公司,國藥準字H20023116)每300 μg 溶解于25 μL 乙二醇/乙醇(V∶V=1∶1)混合液中。

1.1.1.3 儀器 Nikon 熒光顯微鏡、SN-659 型智能放免測量儀、AB204-E 電子分析天平、TGL-16G 臺式離心機、TIZ5-WS 多管架自動平衡離心機、灌胃針、50 μL微量注射器等。

1.1.2 方法

1.1.2.1 種鼠選擇 配種選用SD 清潔級未孕大鼠,雌雄鼠20 對,體質量250～300 g,一對一籠喂養(yǎng)交配,全價營養(yǎng)配方飼料,自飲自食。每天早上定時查看陰栓,有陰栓的選用母鼠飼養(yǎng)于另一只塑料籠盒中,并在籠上貼上標簽,標簽上寫明配種日期、陰栓日期和籠號,籠號順序從1～n 開始編號。

1.1.2.2 動物分組 出現陰栓后第19 天以后每天上、下午定時查看仔鼠出生情況,若有出生則選用雌仔鼠,稱體質量,記錄雌鼠數量,在籠表簽上再填上出生日期。選用4 d 內出生的雌鼠。點數,分籠,分組,分為正常對照組(Normal-Control,NC組)、IPCC 模型組(model,M組)、GnRH-A 對照組(GnRH-A,GA組)、梔早顆粒高劑量組(ZZKL-H組)、梔早顆粒中劑量組(ZZKL-M組)、梔早顆粒低劑量組(ZZKL-L組)。每組鼠數控制在8 只以上,每籠出生鼠由親母自養(yǎng),每籠8 只,若每籠出生雌鼠數量不足8 只,則用該親母生的雄仔鼠湊足8 只,確保每籠內飼養(yǎng)密度一致,體質量一致,以達到飼養(yǎng)條件一致。從出生開始每隔3 d記1 次體質量,每天早上定時記錄,并寫在體質量記錄表上。

1.1.2.3 造模 用酒精棉簽消毒,用50 μL 微量注射器吸取25 μL 達那唑溶解液皮下注射。注射時防止液體溢出,若有溢出則丟棄。模型組、GnRH-A組、梔早顆粒高劑量組、梔早顆粒中劑量組、梔早顆粒低劑量組于出生最早的雌性大鼠為5日齡同1 d 每只皮下注射25 μL 達那唑溶液,正常對照組不予處理。

1.2 SD 大鼠實驗方案

1.2.1 實驗藥物

1.2.1.1 抑那通 注射用醋酸亮丙瑞林(促性腺激素釋放激素類似物制劑)。GnRH-A組以抑那通為對照藥物。抑那通針劑首劑、次劑用量均為2.5 倍臨床等效劑量,分別為1 573.5 μg/kg 和1 180 μg/kg,配制時用原配的溶液溶解,再加滅菌注射用水稀釋而成,濃度分別為157 μg/mL 和118μg/ mL。

1.2.1.2 梔早顆粒中 夏枯草、梔子、柴胡、白芍、荔枝核、牡蠣、瓜蔞、浙貝母、郁金(由江蘇江陰天江制藥有限公司制備),1 劑9 g,用溫開水溶解。梔早顆粒高、中、低劑量組分別按生藥量5.40 g/(kg·d),2.70 g/(kg·d),1.35 g/(kg·d),分別相當于臨床人用量的14 倍、7 倍、3.5 倍灌胃。

1.2.2 實驗給藥方法與劑量 梔早顆粒中藥組大鼠在15日齡時開始用灌胃法喂梔早顆粒,每只每次喂飼3 mL,每天1 次,模型組給予等量的生理鹽水灌胃。GnRH-A組大鼠在15日齡時以抑那通于右后肢處肌注,隔日1 次,首次給藥劑量為1 573.5 μg/kg,次劑用量1 180 μg/kg。大鼠25日齡時開始每天檢查陰門開口情況,如動物在第1 次檢查時陰門已經開口,則陰門開口時間記為25 d。從大鼠陰門開口日起,每天上午定時做陰道涂片,直至大鼠建立正常的性周期。

1.2.3 標本采集及檢測指標 用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg,腹膜內注射)麻醉,麻醉后,摘眼球取血3 mL,室溫凝血后,3 000 r/min,離心20 min,取血清,-20℃凍存,以備檢查血GH、IGF-I 水平。

1.2.4 采用酶聯免疫法檢測 IGF-1 試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA)。已知IGF-1 濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將IGF-1 和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產生顏色,顏色的深淺和樣品中IGF-1 的濃度呈比例關系。GH 試劑盒同理。試劑盒購自美國RD 公司,嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0 統計分析軟件處理資料,計量資料用均數±標準差()表示,采用t 檢驗進行分析。判斷均數差異顯著性,當P ＜0.05時,差異有統計學意義。

2 結果

各組大鼠血清GH 、IGF-I 水平比較,見表1。

表1 各組大鼠血清GH、IGF-I 水平比較()

表1 各組大鼠血清GH、IGF-I 水平比較()

注:與性早熟模型組比較,#P ＜0.05。

3 討論

正常青春發(fā)育的發(fā)動緣于下丘腦脈沖分泌釋放促性腺激素釋放激素(GnRH)而激活垂體—性腺軸的青春發(fā)育過程。而GH-IGF-1 軸是一個對人體內分泌代謝很重要的部分,尤其是調控青春期的生長發(fā)育,且GH 的促生長作用是通過肝腎等組織依賴IGF-I 來介導的,IGF-I 直接作用于靶細胞又對GH 的分泌有著反饋抑制作用。近年來的很多研究[4-9]表明,生長激素(GH)、瘦素(Leptin)、甲狀腺素等很多激素均可對性腺軸產生影響,且發(fā)現IGF-I 是聯系營養(yǎng)和生殖的紐帶,是青春發(fā)動的重要信號之一。性腺軸和促生長軸在青春期生長中有不可分割的有機聯系。青春期的身高突增有賴于兩者的協調調控。如果能明確GH-IGF-I 軸的作用機制將對于指導我們在臨床上相關的疾病診療用藥方面有很高的現實意義。

根據[10]哈爾濱地區(qū)性早熟女童發(fā)病因素的調查及與中醫(yī)辨證分型的關系,發(fā)現哈爾濱市性早熟女童以肝郁化火痰結型為主,治療應以疏肝、清肝、化痰軟堅法為主,同時依據祖國醫(yī)學中醫(yī)女子以肝為先天的理論,結合多年臨床經驗,應用純中藥制劑梔早顆粒于臨床治療性早熟多年,效果顯著。本實驗也為進一步闡明應用梔早顆粒不同劑量來干預性早熟模型大鼠血清GH、IGF-I 的水平機理,從而證實了梔早顆粒高、中組劑量能有效抑制血清GH、IGF-I 的濃度。因此我們可以認為降低GH、IGF-I 的血清水平是梔早顆粒可以有效的減緩第二性征的提前出現,減慢骨齡增長骨骺愈合速度的作用機制之一?；蛟S在其他方面也可以進一步探討梔早顆粒能夠抑制青春期過早啟動,比如明確大鼠下丘腦Leptin 受體,肝臟IGF-ImRNA 表達情況等方面,這些都與性早熟密切相關,值得我們日后更加深入的研究,用更多現代科研手段尋找治療性早熟作用的靶點[11-12]。

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