祝莉莎 趙榮梅 王 毅 高 勇 伊布拉音·艾爾西丁

（1.新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗所，新疆 烏魯木齊 830004；2.新疆喀什地區(qū)藥品檢驗所，新疆 喀什 844000）

尿通卡克乃其片為維吾爾醫(yī)常用成方制劑，由錦燈籠、黃瓜子、血竭、西黃耆膠、阿拉伯膠、巴旦仁、甘草浸膏等10味藥材及輔料組成。具止痛、利尿等功效，臨床用于尿通、尿不盡、尿血、尿道流膿等。該品種收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-維吾爾藥分冊》（1998年版）；甘草浸膏系國家中藥材資源保護品種甘草經(jīng)加工制成的浸膏，在該制劑中為輔助藥用成分。本文就該制劑中的甘草浸膏藥味特征性成分甘草酸和甘草次酸的色譜鑒別方法進行了系統(tǒng)研究，以期為尿通卡克乃其片的內(nèi)在質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器:島津 SPD-10AVP紫外檢測器LC-10AT泵、島津LC-2010A高效液相色譜儀和LC-2010AHT紫外檢測器、Agilent1100高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，美國安捷倫科技），KLZ-UP超純水儀（臺灣艾柯成都康寧實驗專用純水設(shè)備廠）。

1.2 材料與試劑:VP-ODS.6μm×250mm、Agela Technologies Inc.venusil XBP-C18μmA.6×250mm色譜柱；薄層層析硅膠GF254板（中國青島海洋化工廠產(chǎn)預(yù)制板，規(guī)格cm×10cm批號、規(guī)格cm×20cm批號20060627）；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠產(chǎn)預(yù)制板 ， 規(guī) 格cm ×20cm，0.20μm ～0.25μm 批 號20050607）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司），中性氧化鋁（上海五四化學(xué)試劑有限公司），其它化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 供試品：尿通卡克乃其片（批號100601023、100411123、090323001、100115049、091104140、090815103、090509031、090607071、090923100編號依次為：NT1、NT2、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、NT8、NT9、NT10）共十批，由新疆A企業(yè)提供，甘草浸膏陰性對照（生產(chǎn)日期20100722）。

1.4 對照品：甘草酸銨對照品（批號：110731-200615、110731-200614供含量測定用），甘草次酸對照品（批號：110723-200310供含量測定用、批號：110723-200411供薄層掃描法含量測定用），甘草苷對照品（批號：111610-200604供含量測定用），均由中國藥品生物制品檢定研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別方法研究

2.1.1 供試液的制備：供試品溶液：取尿通卡克乃其片1片，研細，甲醇mL，超聲處理分鐘（功率W，頻率kHz），濾過，濾液蒸干，殘渣加水mL使溶解，用乙醚振搖提取2次，每次25mL，棄去乙醚提取液，水層用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次mL,合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解。

甘草浸膏陰性對照溶液：取甘草浸膏陰性樣品1片量，研細，照供試品溶液同法制備，即得。對照品溶液：配制1mg·mL-1甘草酸銨對照品甲醇溶液。

2.1.2 TLC色譜條件：采用硅膠GF254板，乙酸乙酯-甲酸 -冰醋酸 -水（15：1：1:2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視。

2.1.3 供試液的測定：照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述供試液各10μL，分別點于同一硅膠 GF254板上，照.1.2試驗，結(jié)果見圖，10批供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同的熒光熄滅斑點。甘草浸膏陰性對照樣品無干擾。

2.1.4 不同點樣濃度考察：如圖2所示，供試品溶液點樣量在10μL～30μL時的斑點較清晰，甘草浸膏陰性對照溶液在甘草酸銨對照品溶液相應(yīng)位置無干擾。

2.1.5 檢測限：取甘草酸銨對照品，加甲醇制成依次為0.16；0.32；0.48；0.64；0.80；1.0；1.5（mg·mL-1）的對照品溶液。分別于同一硅膠GF254薄層板上點樣10μL，照

2.1.2 試驗，結(jié)果上述濃度均可檢出甘草酸銨斑點，但濃度在0.64 mg·mL-1以上的斑點較清晰。甘草酸銨薄層鑒別的檢測限為（0.16～0.48）mg·mL-1，見圖。

圖1 10批尿通卡克乃其片中甘草酸銨TLC鑒別結(jié)果

圖2 尿通卡克乃其片中甘草酸銨TLC供試品點樣濃度考察

圖3 尿通卡克乃其片中甘草酸銨TLC系統(tǒng)的檢測限考察

2.2 HPLC鑒別方法研究

2.2.1 供試液的制備：供試品溶液：取尿通卡克乃其片1片，除去包衣，研細，置mL量瓶中，加流動相適量，超聲處理10～30min(或振搖10min)使溶散，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，濾液即得。

甘草浸膏陰性對照溶液：取甘草浸膏陰性樣品1片量，研細，照供試品溶液同法制備，即得。對照品溶液的制備：另取甘草酸銨對照品，加流動相制成每1mL含0.14mg的溶液。

2.2.2 HPLC色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇 -0.2mol·L-1乙酸銨溶液 -冰乙酸（65：33：

1）為流動相(pH=5.0±0.5)；柱溫℃；檢測波長為250nm。

2.2.3 供試液的測定：照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ D）試驗。分別精密量取2.2.1項下的供試液各20μL，照2.2.2項下方法試驗，結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與甘草酸銨對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，甘草浸膏陰性對照溶液無干擾，代表性圖譜見圖。

圖4 尿通卡克乃其片-甘草浸膏HPLC色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察：精密稱取甘草酸銨對照品適量用流動相溶解并稀釋制成濃度系列，照2.2.2項下方法依法測定其峰面積（Y），以濃度為橫坐標(biāo)（X），進行回歸，得線性方程，見表1。

表1 甘草酸銨對照品溶液線性方程及范圍

2.2.5 檢測限：直觀法信噪比（S/N）3：1方法的最低檢測限確定為.166μg，以信噪比（S/N）10：1確定最底檢測量限為.416μg。見圖。

圖5 尿通卡克乃其片-甘草酸銨HPLC檢測限

2.2.6 精密度試驗：日內(nèi)精密度(n=7)RSD為.6%；日間精密度（n=4）RSD為.4%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液分別于、1、2、6、12、26h，測定其峰面積，RSD為.8%（n=6），認為供試品溶液在26小時穩(wěn)定。

2.2.8 耐用性試驗：取同批供試品，比較振搖10min、超聲min、10min、20min、30min的結(jié)果，除超聲min時的結(jié)果差異較大外，其他處理條件樣品間的結(jié)果RSD為1.6%～2.8%。

在柱溫20℃～35℃條件下，改變流動相的比例、pH值、柱溫、不同色譜柱（3根）、流速，在不同色譜儀（3臺）上進行實驗，均能重現(xiàn)，分離度均符合要求。經(jīng)試驗測得理論塔板數(shù)多在1200～3300之間，分離度均大于1.5，保留時間隨甲醇比例的增減而提前或延后，一般在10min～20min之間。

2.2.9 回收率實驗：精密稱取尿通甘草浸膏陰性對照樣品約0.5g（甘草酸銨理論含量為0）共9份，分別精密加入高、中、低甘草酸銨對照品溶液各3份，照.2.1項下同法制備供試品溶液，按2.2.2項下方法試驗，結(jié)果：低（47.24μg·mL-1）、中（81.12μg·mL-1）、高（130.92μg·mL-1）3個濃度的添加回收率分別為.7%（RSD1.9%）、87.9%（RSD0.5%）、89.1%（RSD0.8%），3個濃度的平均回收率為85.9%，RSD=4.7%。

2.2.10 線性回收率實驗：精密稱取甘草酸銨對照品約12mg（11.81mg）加流動相溶解制成.4μg·mL-1的儲備液（GD3）。另精密稱取甘草浸膏陰性樣品約0.5g份，分 別 精 密 加 入 GD3.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、10.0mL、13.0mL,照.2.1項下同法制備供試品溶液，按.2.2項下方法依法測定其峰面積（Y），以濃度為橫坐標(biāo)（X），進行回歸，得線性指數(shù)方程，Y=141959e0.4591X （r=0.9804）， 在.4～122.8μg·mL-1（0.188μg～2.456μg）范圍內(nèi)呈指數(shù)線性，見圖。

圖6 尿通卡克乃其片－甘草酸銨加樣HPLC線性

3 討論

3.1 鑒別用對照品或?qū)φ账幉牡倪x擇 本制劑處方工藝中使用的是甘草浸膏，目前未生產(chǎn)甘草浸膏對照藥材，其特征成分主要為甘草酸、甘草苷等，而其中甘草苷的含量較低，排除使用甘草苷對照品，而選擇甘草酸銨、甘草次酸為對照品進行分析。為保持與《中國藥典》一致，僅采用甘草酸銨對照品進行研究。同時建議開展甘草浸膏對照藥材的研制工作。

3.2 TLC鑒別展開系統(tǒng)的選擇 除2.1.2的TLC鑒別展開系統(tǒng)外，還采用硅膠GF254板，對文獻報道[2-7]的種展開劑進行了研究。結(jié)果：展開系統(tǒng)[3]石油醚（60～90°C）-苯 -乙酸乙酯 -冰乙酸（10：22：6：0.45）適合甘草次酸成分的鑒別。

3.3 TLC鑒別供試品溶液制備方法的選擇 除2.1.1的TLC鑒別供試品溶液制備方法外，還采用2.1.2的TLC鑒別展開系統(tǒng)，對文獻報道[2-7]的7種供試品溶液制備方法進行了嘗試。結(jié)果：方法[3]“取本品1片，研細，加鹽酸mL及氯仿mL，超聲min，濾過，蒸干，殘渣加無水乙醇5mL溶解”適合甘草次酸的提取。

3.4 HPLC色譜系統(tǒng)的選擇 除2.2.2所述的條件外，還考察了：①《中國藥典2005年版二部》“復(fù)方甘草片”中甘草酸含量測定項下的色譜條件；文獻[1]②中嗎啡測定的色譜條件;③血竭測定的色譜條件。結(jié)果：均不適合甘草酸銨測定。

3.5 HPLC用供試品溶液制備方法的選擇.2.1供試品溶液制備系采用《中國藥典》2005年版一部“甘草浸膏”含量測定項下的供試品溶液制備方法，結(jié)合處方中甘草浸膏的用量，經(jīng)換算將供試品的取用量改為1片量細粉，置25mL量瓶中，溶解后不再稀釋，濾液直接測定。供試品溶液制備方法也曾采用水、甲醇、50%甲醇作為溶劑，但均不如采用流動相制備的供試品試液色譜圖干擾少。

3.6 HPLC未能收載為含量測定方法的原因 在線性回收率實驗中發(fā)現(xiàn)，在陰性對照取樣量不變的條件下，加入甘草酸銨對照品的量與所測得的峰面積在一定范圍內(nèi)呈指數(shù)線性，其相關(guān)系數(shù)僅為0.9804，低于同系統(tǒng)單純甘草酸銨對照品溶液線性相關(guān)系數(shù)0.9997，小于方法定量線性相關(guān)系數(shù)0.995?？赡苁窃斐傻?、中、高三種濃度的回收率差異較大的原因之一，制劑中的其他組分或成份對不同濃度甘草酸銨是否有吸附作用還有待于進一步研究，故未能收載為含量測定方法。

3.7 小結(jié)：HPLC與TLC比較，兩者均采用甘草酸銨為對照品，色譜系統(tǒng)及色譜條件均與《中國藥典2005年版一部》“甘草浸膏”相對應(yīng)，但HPLC供試品的制備方法合理、對照品溶液濃度適宜，色譜柱類型、檢測方式及參數(shù)合理，方法重現(xiàn)性較好，專屬性、耐用性及靈敏度均有更強的優(yōu)勢，且可為將來指紋圖譜研究奠定基礎(chǔ)。

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