■ 周金慧 李熠 吳黎明 陳蘭珍 薛曉鋒 張金振 陳芳 王鵬 黃京平 郭偉華 趙靜*

（作者周金慧、李熠、吳黎明、陳蘭珍、薛曉鋒、張金振、陳芳、王鵬、黃京平、郭偉華、趙靜單位為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所、農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京）、農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室）

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜和蜜露通過(guò)與自身物質(zhì)混合以后，釀造而成的天然甜味物質(zhì)。蜂蜜含有葡萄糖、果糖、氨基酸、酶、礦物質(zhì)、黃酮、酚酸等活性組分，另外還含有小部分的花粉和蜂蠟。多酚黃酮類化合物在植物中普遍存在，按結(jié)構(gòu)可分為黃酮醇、黃酮類、二氫黃酮類、異黃酮、兒茶酚、花色素和查爾酮。這些化合物具有相同的基本骨架即含有15個(gè)C原子的C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)中間連有雜環(huán)吡喃或吡喃酮的苯環(huán)構(gòu)成。黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)變化主要是由于羥基、氧原子和結(jié)合到環(huán)上的氫原子的數(shù)目和位置上存在差異產(chǎn)生的。這一類化合物能夠調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育，并且具有多種生物學(xué)作用如抗過(guò)敏，消炎殺菌，抗癌，防血栓和擴(kuò)張血管活性。在這些研究中，黃酮類化合物可以作為金屬螯合劑和自由基清除劑來(lái)發(fā)揮抗氧化作用，通過(guò)抑制酶活性或螯合微量金屬元素來(lái)清除羥自由基。

許多方法利用黃酮類和多酚類化合物作為特征化合物對(duì)不同植物源的蜂蜜進(jìn)行指紋圖譜分析，如高效液相色譜法(HPLC) ，氣相色譜法，配有不同檢測(cè)器的毛細(xì)管電泳法。結(jié)構(gòu)上共軛雙鍵和芳香鍵的存在使得黃酮類化合物在紫外區(qū)280nm和360nm有較強(qiáng)的吸收。電子捕獲檢測(cè)器(ECD)在黃酮類化合物分析中具有很好的選擇性和靈敏度，其主要原理是基于對(duì)分析物在合適的電極庫(kù)倫陣列檢測(cè)器中發(fā)生的氧化/還原反應(yīng)所產(chǎn)生的電流進(jìn)行測(cè)定。在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析中，配備有電噴霧(ESI)或大氣壓化學(xué)電離源(APCI)能夠?qū)Υ郎y(cè)的黃酮類化合物進(jìn)行定性和定量分析，從而能夠提高方法的靈敏度和特異性。基于色譜技術(shù)構(gòu)建的指紋圖譜是對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)時(shí)，能夠反映化學(xué)成分組成的特征性指紋輪廓。由于天然物質(zhì)的基質(zhì)復(fù)雜性，指紋圖譜技術(shù)在分析樣品的鑒別和分類方面發(fā)揮著重要的作用?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)方法能夠從得到的化學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)中最大限度地提取有用的化學(xué)信息，其最大的特點(diǎn)是將多變量分析方法引入到了化學(xué)研究領(lǐng)域。近些年來(lái)在農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)地和植物源分析中得到了廣泛的應(yīng)用。其中，主成分分析(PCA)，偏最小二乘法 (PLS)，偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和簇類獨(dú)立軟模式法(SIMCA)廣泛應(yīng)用于對(duì)模型復(fù)雜的化合物或生物學(xué)數(shù)據(jù)的建模和分析。

蜂蜜中的某些活性組分盡管含量較低但確是決定蜂蜜價(jià)格或等級(jí)的主要因素，而這些微量活性組分含量的差異是由蜜源植物決定的。市場(chǎng)上不同蜜源植物的蜂蜜價(jià)格不一樣，這也是導(dǎo)致蜂蜜造假的原因之一。本研究通過(guò)分析蜂蜜中黃酮類化合物的真實(shí)含量及其范圍，初步確定特征標(biāo)識(shí)物，構(gòu)建蜂蜜的指紋圖譜并提取化學(xué)計(jì)量學(xué)信息從而鑒別荊條蜜和油菜蜜。

實(shí)驗(yàn)

1. 實(shí)驗(yàn)材料

黃酮類化合物包含蘆丁(95%)、楊梅酮(96%)、槲皮素 (98%)、莰菲醇(97%)、芹菜素(95%)、松屬素(95%)、苛因(97%)、高良姜素 (95%)、桑色素(95%)、阿魏酸(99%)，柚皮素(98%) 和咖啡酸苯乙酯 (97%)。黃酮類化合物購(gòu)買(mǎi)自sigma公司(St. Louis, MO, U.S.A.)。乙腈，甲醇和甲酸為HPLC級(jí)(DIMA Technology Inc, Richmond,U.S.A.)。鹽酸(37%)為分析純?cè)噭?，?gòu)買(mǎi)于北京化學(xué)試劑公司。Milli-Q純水(Bedford, MA, USA)。固相萃取(SPE)柱(Oasis HLB, 500mg/6mL)，(Milford, MA, USA)。

2. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)貯備液制備:分別用甲醇溶解黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品使其濃度范圍為0.1～0.8 mg/mL?；旌现虚g溶液用甲醇按1:10稀釋原貯備液?；诒狙芯繖z測(cè)靈敏度和線性范圍配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫旌现虚g溶液在2～6℃冰箱中保存。

HPLC-DAD條件：采用Agilent LC 1200系統(tǒng)(Agilent,Waldbronn, Germany) ，包括真空脫氣機(jī)(G1322A)、二元溶劑泵(G1312B)、自動(dòng)進(jìn)樣器(G1367D)、柱溫箱(G1316B)和二極管陣列檢測(cè)器(G1315C)，用來(lái)構(gòu)建指紋圖譜。色譜分離采用Zorbax SB-C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) (Agilent, Wilmington, DE)。黃酮類化合物溶液用二元梯度洗脫分離。流動(dòng)相：A：純水，B：甲醇；梯度分離程序如下：0～15 min,10～25% (B); 15～20 min, 25～30% (B); 20～30 min, 30～35% (B); 30～35 min,35～70% (B); 35～40 min,等度洗脫進(jìn)一步用5 min; 40～42 min, 70～10% (B); 42～50 min, 10%(B)。柱溫30℃；流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

3. 質(zhì)譜條件

安捷倫6460三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜，配有電噴霧離子源(ESI)接口和用來(lái)質(zhì)譜分析和目標(biāo)化合物量化的安捷倫射流離子聚焦(Agilent Technologies, Palo Alto, USA)。負(fù)離子方式檢測(cè)。調(diào)節(jié)參數(shù)使目標(biāo)物分析條件最優(yōu)化：氣體溫度350℃，干燥氣流速 6 L min-1，霧化器壓力35 psi，毛細(xì)管電壓：3500 V，鞘流氣氣體溫度: 350 ℃，鞘流氣氣體流速: 9 L min-1,噴嘴電壓: 1000 V。表1顯示了黃酮類化合物母離子過(guò)渡到產(chǎn)物離子過(guò)程中采用的質(zhì)譜參數(shù)。系統(tǒng)操作、數(shù)據(jù)獲取和分析均采用MassHunter軟件控制和處理。

表1. 12種黃酮類化合物的質(zhì)譜參數(shù)

4. 樣品制備

2009年3月和9月之間從中國(guó)不同省份采集187個(gè)蜂蜜樣品，其中荊條蜜98個(gè)，油菜蜜89個(gè)。樣品避光室溫保存。分析前，若蜂蜜結(jié)晶，可以在恒溫水浴鍋不超過(guò)50℃條件下緩慢加熱融化。

稱取10 g 蜂蜜樣品于50 mL聚丙烯離心管中，30 mL純水混合，HCl調(diào)節(jié)pH到2，磁力攪拌器攪拌15 min至完全成為流體狀。然后10,000 rpm下離心10 min，去除雜質(zhì)。上清液轉(zhuǎn)移到Oasis HLB固相萃取柱中上樣。萃取柱提前用10 mL甲醇，10 mL純水(HCl酸化，pH為2)活化。上樣后萃取柱用10 mL純水淋洗，吸附的黃酮類化合物用3 mL甲醇洗脫。洗脫液40℃下氮?dú)獯蹈蓾饪s。殘留物用1 mL的純水：乙腈 (70:30)復(fù)溶。之后樣品在漩渦儀混合2 min，用0.25 μm 微孔濾膜過(guò)濾，最后的溶液轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣小瓶，待HPLC-DAD-MS/MS分析。

黃酮類化合物的鑒定和分析采用安捷倫科技公司的MassHunter軟件。指紋圖譜和蜂蜜樣品的相似性用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)估系統(tǒng) ( 2004A 版本)”，該系統(tǒng)由國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)推薦，主要用于windows色譜相似度分析。多元分析包括PCA、PLS、PLS-DA 和SIMCA采用MATLAB 2009b軟件 (The Mathworks Inc., Natick, Mass., U.S.A.)。

結(jié)果和分析

1. 色譜條件

乙腈和甲醇作為流動(dòng)相廣泛用于LC-MS/MS分析，因此可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例來(lái)提高黃酮類化合物的分離度。和甲醇相比，使用乙腈作為流動(dòng)相使黃酮類化合物具有更高的靈敏度和更尖銳的峰形狀。而甲醇作為流動(dòng)相使黃酮類化合物色譜峰中有更好的分辨率。提高水相濃度或者降低乙腈含量能夠顯著地提高黃酮類化合物的保留能力和分辨率。黃酮類化合物有兩個(gè)紫外吸收波段：苯環(huán)結(jié)構(gòu)的最大紫外吸收波長(zhǎng)范圍為260～280 nm，肉桂酰結(jié)構(gòu)的最大紫外吸收波長(zhǎng)范圍為350～370 nm。所以，本研究分別在波長(zhǎng)270 nm和360 nm處構(gòu)建蜂蜜樣品中黃酮類化合物的指紋圖譜。

2. 質(zhì)譜

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃酮類化合物在正離子和負(fù)離子模式下均能夠進(jìn)行分析。全掃描質(zhì)譜中，檢測(cè)質(zhì)子化的和非質(zhì)子化的12個(gè)黃酮類化合物的分子離子[M+H]+和[M-H]-來(lái)比較它們的豐度。在ESI電離源正離子模式條件下，除了楊梅酮外，其它黃酮類化合物都有較高響應(yīng)值(圖1)。但是正離子化模式下，總離子色譜圖中一些目標(biāo)物容易被其它化合物干擾并且楊梅酮無(wú)響應(yīng)。所以在用質(zhì)譜分析黃酮類化合物時(shí)，采用負(fù)離子ESI模式以得到相對(duì)穩(wěn)定和更佳的選擇性和靈敏度。

3. 樣品凈化步驟

圖1 12種黃酮類化合物在正離子和負(fù)離子模式下的總離子流圖。保留時(shí)間依次為阿魏酸(18.1), 柚皮素(19.3), 蘆丁(26.6),楊梅酮(28.3), 桑色素(30.6), 槲皮素(33.8), 莰菲醇(34.1), 柯茵(38.5), 松屬素(39.8), 芹菜素(44.1), 高良姜素(46.4)和咖啡酸苯乙酯(46.8)。

由于蜂蜜基質(zhì)中含有大量的具有不同的理化性質(zhì)的黃酮類化合物，因此，很難從中將黃酮類化合物完全分離出來(lái)。用酸性水溶液溶解蜂蜜并且使其中的蛋白質(zhì)變性，從而從蜂蜜樣品中提取盡可能多的黃酮類化合物。沉淀下來(lái)的雜質(zhì)和變性的蛋白質(zhì)通過(guò)離心去除。上清液通過(guò)固相萃取柱過(guò)濾去除極性物質(zhì)。在固相萃取柱洗脫實(shí)驗(yàn)中，純水可以達(dá)到較好的淋洗效果，如果在純水中增加甲醇含量則導(dǎo)致黃酮類化合物回收率降低和指紋圖譜中色譜峰數(shù)量的減少。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，10 mL純水和3 mL甲醇即可達(dá)到較好的洗滌和洗脫效果。

（未完待續(xù)）