王波 王彬 張連斌 初向陽 余剛

肺癌是當(dāng)前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的發(fā)病率最高，占80%左右[1,2]。早期的NSCLC患者，治療原則以手術(shù)為主，術(shù)后根據(jù)分期等進行輔助性化療。然而在諸多輔助化療方案中，僅有部分腫瘤患者從化療獲益。以鉑類聯(lián)合三代新藥（長春新堿，紫杉醇、吉西他濱、培美曲塞等）是治療NSCLC的基本方法，但有效率卻僅達25%-30%[3]?？赡芘c化療反應(yīng)率低或?qū)β?lián)合化療過程中產(chǎn)生的原發(fā)或繼發(fā)性藥物耐藥有關(guān)。而腫瘤細胞檢測相關(guān)基因表達水平的異?？赡芘c肺癌產(chǎn)生耐藥的有密切關(guān)系。最常見的化療療效預(yù)測因子是鉑類藥物耐藥因子ERCC1和吉西他濱耐藥因子RRM1[4-6]?？刮⒐芤蜃覶UBB3和STMN1是長春新堿、紫杉類、多西他賽等化療藥物的主要耐藥因子，這些耐藥因子與化療藥物的關(guān)系已經(jīng)闡明[7,8]。近期研究發(fā)現(xiàn)這些耐藥因子受到腫瘤信號通路因子的調(diào)控，但還沒有明確結(jié)論。本研究主要探討抗微管類的靶點TUBB3和STMN1與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）通路的關(guān)鍵因子的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 從53例NSCLC患者中篩選出完整臨床病理資料的46例NSCLC手術(shù)組織標(biāo)本（2012年5月-2013年5月）來自于中國人民解放軍總醫(yī)院胸外科，其中男性22例，女性24例，術(shù)后病理分期，T1期21例；T2期23例；T3期2例；T4期0例。

1.2 樣本采集及檢測方法

1.2.1 樣本處理 新鮮手術(shù)組織用10%中性福爾馬林固定16 h-24 h，酒精洗滌固定后，送至廣州益善醫(yī)學(xué)檢驗所進行檢測。

1.2.2 mRNA表達檢測技術(shù) 檢測方法為分支DNA-液相芯片法，同時定量檢測TUBB3、STMN1基因mRNA表達，分支DNA液相芯片技術(shù)是不進行RNA抽提、純化和逆轉(zhuǎn)錄等步驟實現(xiàn)對mRNA表達水平的直接檢測的技術(shù)。在裂解樣本后，通過微球捕獲，采用探針的多位點特異配對、級聯(lián)放大的方式來實現(xiàn)信號的放大，讀數(shù)時采用液相芯片進行結(jié)果的判讀，可以在一次反應(yīng)中同時檢測多種靶標(biāo)基因的mRNA表達水平，具體步驟包括：①取適量FFPE樣本加入裂解液，56oC下裂解反應(yīng)2 h；②預(yù)雜交：將樣本裂解液轉(zhuǎn)至孵育板上，加入支持探針-微球、支持延伸探針、緩沖液，55oC震蕩孵育過夜；③吸取上清：次日將孵育板放在磁力架上1 min，此時磁性微球聚集在底部，吸取棄去上清；④洗滌：加入洗滌液，震蕩洗滌1 min，孵育板放在磁力架上1 min，吸取棄去上清；重復(fù)3次；⑤雜交：加入擴增延伸探針和標(biāo)記探針，50oC震蕩反應(yīng)1 h；⑥洗滌：孵育板放在磁力架上1 min，吸取棄去上清；用洗滌液洗2次；⑦信號放大：加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，50oC震蕩反應(yīng)30 min；⑧洗滌：孵育板放在磁力架上1 min，吸取棄去上清；用洗滌液洗2次；⑨讀數(shù)：加入洗滌液，震蕩5 min，于Luminex閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)；⑩分析：數(shù)據(jù)分析，得出檢測結(jié)果。

1.2.3 基因突變檢測技術(shù) 采用SurPle?x-xTAG70plex液相芯片技術(shù)對組織樣品進行EGFR、KRAS、BRAF、PI3K基因突變檢測。該技術(shù)建立在Luminex平臺上，是一種集合流式細胞技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)字信號處理技術(shù)及傳統(tǒng)芯片技術(shù)為一體的新型生物檢測技術(shù)，液相芯片技術(shù)的技術(shù)步驟可分為微球編碼、探針偶聯(lián)、液相懸浮反應(yīng)和檢測分析。通過多重PCR方法獲得各基因外顯子上含有常見等位基因型的基因片段，進行等位基因特異引物延伸（allele specific primer extension, ASPE）反應(yīng)，ASPE引物上的Tag（微球）序列與聚苯乙烯微球上的Anti-Tag序列特異結(jié)合，完成雜交反應(yīng)，雜交后的微球通過Luminex 200系統(tǒng)進行分析，讀取每個樣品的中位熒光值（MFI）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Shapiro-Wilk（簡稱W檢驗）、Kolmogorov-Smirnov檢驗（檢測KS檢驗）與D檢驗，進行正態(tài)分布的考察。根據(jù)正態(tài)分布結(jié)果，選擇Pearson或Spearman相關(guān)性分析。以P=0.05為檢驗水準(zhǔn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床基線特征 46例NSCLC患者臨床特征描述見表1。

2.2 TUBB3及STMN1 mRNA表達水平檢測 采用分支-DNA液相芯片技術(shù)對TUBB3及STMN1進行檢測，內(nèi)參基因為一組基因（B2M, TBP, TFRC）。不同于Q-PCR，該技術(shù)無需RNA提取及PCR擴增。46例NSCLC標(biāo)本中TUBB3的平均表達水平為0.185（0.07-0.721），STMN1的平均表達水平為1.328（0.70-4.80）。

表 1 患者基線臨床特征描述Tab 1 Characteristics of patients

2.3 EGFR通路關(guān)鍵基因突變檢測 采用xTAG技術(shù)進行EGFR E18、E19、E20、E21，KRAS E2、E3，BRAF，PI3K E9、E20突變分析。結(jié)果如表2所示，46例標(biāo)本中，EGFR突變率50%（23/46），KRAS突變率13.1%（6/46）。PI3K突變率2.2%（1/46），沒有發(fā)現(xiàn)BRAF突變。

2.4 正態(tài)分布檢驗及相關(guān)性分析 正態(tài)性是進行Pearson關(guān)聯(lián)性分析的前提假設(shè)，若變量不滿足正態(tài)性，則不能采用Pearson相關(guān)進行分析，只能采用Spearman相關(guān)進行分析。因此在進行相關(guān)性分析前應(yīng)對變量的正態(tài)性進行檢驗。本研究采用Shapiro-Wilk（簡稱W檢驗）、Kolmogorov-Smirnov檢驗（檢測KS檢驗）與D檢驗考察TUBB3和STMN1的正態(tài)分布，如果P值大于0.10可認(rèn)為變量服從正態(tài)分布。本研究的STMN1和TUBB3的所有正態(tài)性檢驗結(jié)果都不滿足P大于0.10這個條件，可認(rèn)為STMN1與TUBB3不服從正態(tài)分布，因此，本研究不能采用Pearson相關(guān)進行分析，而采用Spearman相關(guān)進行分析。

2.5 TUBB3/STMN1及EGFR通路臨床病理特征與臨床特征的相關(guān)性 結(jié)果顯示，TUBB3及STMN1的mRNA水平的表達與性別、年齡、分化程度、遠處轉(zhuǎn)移等病理特征沒有明顯差異。EGFR E19突變與吸煙史相關(guān)（P=0.001,2），與其他病理特征沒有明顯差異（表3）。

2.6 TUBB3/STMN1與EGFR通路關(guān)鍵因子突變相關(guān)性分析 采用Spearman方法分析TUBB3/STMN1 mRNA表達之間的相互關(guān)系，結(jié)果顯示：TUBB3和STMN1存在很強的共表達性，TUBB3基因高表達時，STMN1趨向于高表達（P=0.006）。通過分析TUBB3/STMN1 mRNA與EGFR突變及KRAS突變的相互關(guān)系，結(jié)果顯示：EGFR E21突變與TUBB3存在負相關(guān)關(guān)系：EGFR E21無突變時TUBB3趨向于高表達（P=0.004,6）。KRAS E2突變與STMN1存在正相關(guān)關(guān)系：KRAS E2突變時STMN1趨向于高表達（P=0.038,6）（表4）。

表 2 基因突變分析Tab 2 Mutations of genes

表 3 基因表達及突變與臨床病理特征的相關(guān)性。Tab 3 Correlation between gene and pathology characteristics

表 4 基因相關(guān)性分析Tab 4 Correlations between genes

在多重檢驗時需將檢驗水準(zhǔn)進行調(diào)整，結(jié)果才具有更高的重復(fù)性。本文中P值計算經(jīng)Bonferroni法調(diào)整后，檢驗水準(zhǔn)設(shè)定為0.0004。

3 討論

隨著人類基因組學(xué)及功能基因組學(xué)研究的不斷深入，分子標(biāo)志物指導(dǎo)肺癌個體化治療已成趨勢。根據(jù)患者基因狀況等個體差異來制訂針對性的治療方案，可以避免不當(dāng)治療及無效治療，而確定個體差異則主要通過檢測分析患者特定基因的表達水平或突變來實現(xiàn)。

多項研究發(fā)現(xiàn)切除修復(fù)交叉互補基因1（ERCC1）、核糖核苷酸還原酶M1（RRM1）、微管蛋白β-III（TUBB3）、Stathmin 1（STMN1）、胸苷酸合成酶（TYMS）、與NSCLC的化療療效直接相關(guān)[7-10]。本研究主要針對抗微管類的耐藥因子TUBB3及STMN1進行。

細胞內(nèi)微管蛋白分α、β兩個亞型，是有絲分裂時紡錘體的基本組成單位，也是抗微管藥物的主要作用靶點。研究顯示，TUBB3編碼的Tubulin-III（β-3型微管蛋白）與抗微管化療藥敏感性的關(guān)系最密切。高TUBB3表達水平與長春瑞濱的耐藥性和生存期較短相關(guān)[11,12]。

STMN1基因同樣是抗微管類藥物的靶點，該基因編碼的STMN1蛋白通過促進微管的解聚或阻止微管的聚合從而影響有絲分裂紡錘體的形成[12]。研究表明STMN1基因的mRNA表達水平與抗微管類化療的療效密切相關(guān)。其中一項NSCLC的臨床研究顯示，STMN1高表達患者紫杉類化療有效率低28.33%，而STMN1低表達患者化療有效率高60.00%（P=0.021）[13]。

腫瘤細胞EGFR信號通路上基因的突變狀態(tài)決定著EGFR靶向藥的療效，研究得出與其療效有關(guān)的突變位點主要有EGFR外顯子18、19和21的突變，KRAS外顯子2和3的突變，BRAF V600E點突變以及PI3K外顯子9和20的突變[14,15]。KRAS的突變在NSCLC患者中的發(fā)生率為10%-20%。既往研究證實KRAS的突變與性別、年齡、腫瘤分期以及臨床表現(xiàn)都沒有明顯聯(lián)系，但在不吸煙患者和病理類型為腺癌的患者中發(fā)生的幾率明顯升高。另有研究表明KRAS突變會影響EGFR-TKIs治療的療效，對存在KRAS基因突變的NSCLC患者應(yīng)用EGFR-TKIs治療的療效明顯降低，KRAS基因突變狀態(tài)可以作為NSCLC患者是否采用EGFR-TKIs治療的篩選標(biāo)準(zhǔn)[15,16]。

本研究主要分析EGFR突變、KRAS突變與TUBB3及STMN1的mRNA表達之間的關(guān)系，探索不同分子標(biāo)志物的相關(guān)性，嘗試揭示化療藥物的耐藥性機制。2008年的IPASS研究是肺癌個體化治療的里程碑，該研究除了發(fā)現(xiàn)EGFR突變與EGFR-TKI療效明確相關(guān)外，也發(fā)現(xiàn)了EGFR敏感突變的患者接受化療的效果要比EGFR野生型患者效果好[17]，提示了EGFR突變可能與化療的耐藥因子的相關(guān)性。隨后的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)：ERCC1基因與EGFR突變存在相關(guān)性，EGFR突變時，ERCC1趨向于低表達[18]。

本研究中分析了TUBB3和STMN1和EGFR信號通路的關(guān)系。檢測mRNA水平采用的方法是分支-DNA液相芯片，檢測過程中無需進行RNA抽提、純化和逆轉(zhuǎn)錄等，一方面檢測結(jié)果基本不受樣品中RNA降解等因素的影響，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；另一方面，液相芯片以多個持家基因作對照（n≥3），準(zhǔn)確性高使檢測結(jié)果更為可靠。同時，本液相芯片使用的是探針的多位點特異配對、級聯(lián)放大的方式來實現(xiàn)信號的放大，與傳統(tǒng)的real time PCR（qPCR）方法相比，可同時檢測超過30個基因，大大減低操作過程或多步驟誤差積累對結(jié)果的影響。

本研究檢測基因突變的方法是xTAG液相芯片方法，該方法可同時檢測EGFR通路70個位點，真正做到多靶標(biāo)聯(lián)合檢測。與其他技術(shù)相比，該技術(shù)具有靈敏高、特異性強、量化可重復(fù)、操作簡便、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)化等突出優(yōu)勢，實現(xiàn)了高度靈敏、重復(fù)性好的多指標(biāo)基因突變檢測在臨床腫瘤靶向治療的運用。

在選擇可靠技術(shù)的前提下，我們對結(jié)果進行了分析。通過分析基因與臨床病理特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，由于本研究中樣本量較少，沒有發(fā)現(xiàn)基因與臨床病理特征如性別、年齡、腫瘤大小等的明顯差異。由于隨訪數(shù)據(jù)還在進行，本文無法分析TUBB3及STMN1與預(yù)后的相關(guān)性。

針對EGFR通路的研究中，本文發(fā)現(xiàn)EGFR敏感性突變（EGFR E18、E19、E21）的突變率達50%，KRAS突變率13.1%。文獻中報道的中國人群EGFR突變率一般30%-40%，這可能與本文的樣本量較少有關(guān)。在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)不吸煙的患者中更容易出現(xiàn)EGFR E19的突變，這與之前的報道較為一致，而KRAS的突變和吸煙史沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異。

關(guān)于TUBB3/STMN1與EGFR突變的相關(guān)性的報道較少。Levallet等2012年報道顯示：KRAS突變導(dǎo)致TUBB3高表達（P＜0.001）的主要因素，通過基因敲除實驗，證明了KRAS信號通路可能是調(diào)控TUBB3基因表達的關(guān)鍵因子[19]，提示了基因突變在化療藥物耐藥的機制的作用。

本研究的TUBB3和STMN1基因表達的相關(guān)性分析結(jié)果顯示：TUBB3和STMN1存在共表達。將TUBB3和STMN1共同與EGFR通路關(guān)鍵因子突變進行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：EGFR E21無突變時TUBB3趨向于高表達（P=0.004,6），而STMN1表達與EGFR E21有相關(guān)性，但沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異（P=0.513,1）。KRAS E2突變與STMN1存在正相關(guān)關(guān)系，KRAS E2突變時STMN1趨向于高表達（P=0.038,6）。而TUBB3表達與KRAS突變有相關(guān)性，但沒有顯著性差異（P=0.26）。

這些結(jié)果顯示EGFR信號通路的關(guān)鍵因子EGFR、KRAS在調(diào)控TUBB3/STMN1基因表達方面可能起著關(guān)鍵作用。TUBB3/STMN1都是抗微管藥物的相關(guān)靶點，抗微管類藥物是作用于細胞微管，通過影響紡錘體的形成，從而抑制細胞有絲分裂。STMN1/TUBB3的表達水平與有絲分裂的活動相關(guān)，抑制這些基因的表達，可以干擾細胞的各種功能，從而影響腫瘤細胞的增殖與凋亡。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KRAS的突變會導(dǎo)致STMN1的高表達，表明了EGFR通路中的基因活化狀態(tài)與細胞的增殖活動密切相關(guān)。Levallet報道中稱，TUBB3基因在支氣管細胞中的表達與PI3K/AKT/mTOR通路或KRAS/RAF/MEK等通路相關(guān)，這些通路上基因的活化狀態(tài)，是否影響著細胞的有些分裂，需要進一步的RNAi試驗及PI3K或MEK抑制劑來研究，確定下一步的機制，從而為化療耐藥機制提供重要基礎(chǔ)。

本研究沒有顯示出兩個指標(biāo)與EGFR突變或KRAS突變的一致相關(guān)性。這些可能是由于樣本數(shù)量少的原因，需要擴大樣本量進一步驗證。也可能EGFR通路在調(diào)控兩個基因的表達時，存在差異性。這些都需要在進一步的大樣本研究中驗證。由于BRAF、PI3K基因在本文中突變較少，達不到統(tǒng)計學(xué)要求，因此沒有進行相關(guān)性分析，這些因子是否也調(diào)控著TUBB3/STMN1的表達，需要進一步的研究來驗證。

本研究初步分析了TUBB3/STMN1表達與EGFR信號通路的關(guān)鍵因子EGFR、KRAS突變的關(guān)系，初步結(jié)果驗證了該信號通路在調(diào)控化療耐藥基因表達的作用。為個體化分子標(biāo)志物提供了很好的依據(jù)。提示了個體化分子標(biāo)志物臨床應(yīng)用過程中，聯(lián)合多個分子標(biāo)志物的分析，能提供更系統(tǒng)的參考依據(jù)，而接下來的工作需要進一步研究調(diào)控的機制。