張 慧 鄭曉冬 姜 侃 汪 新 陳小珍

（1.浙江省質(zhì)量檢測(cè)科學(xué)研究院理化分析檢測(cè)部，浙江 杭州 310013；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

費(fèi)氏新薩托菌（Neosartoryafischer）是一種耐熱、耐干燥、耐酸堿的菌種，廣泛分布于土壤尤其是果園的土壤中，是果蔬汁中易污染的耐熱霉菌之一。它不僅是飲料和熱加工食品中的有害菌，易引起食品貯存期間的腐敗變質(zhì)［1－4］，也是人畜共患的致病菌，可引起角膜炎、心內(nèi)膜炎和肺部曲霉病等，還可產(chǎn)生真菌毒素，嚴(yán)重威脅人們的身體健康［5－8］。目前耐熱霉菌的檢測(cè)通常采用PDA平板培養(yǎng)方法，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)［2］，因此，快速、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)逐漸用于耐熱霉菌的檢測(cè)［9］。有研究［10，11］采用普通 PCR 技術(shù)，利用包含在核糖體單位的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)上的序列作為特異性引物，實(shí)現(xiàn)費(fèi)氏新薩托菌的快速鑒別，但采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)快速檢測(cè)費(fèi)氏新薩托菌的研究較少。

Beta－tubulin基因序列是耐熱霉菌——費(fèi)氏新薩托菌的保守序列，本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)特異性引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)體系的組成，建立實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法，對(duì)果蔬汁產(chǎn)品質(zhì)量有效控制和保障食品安全，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株及來源

費(fèi)氏 新 薩托 菌 （Neosartoryafescheri）ATCC66640、ATCC66641，雪 白 絲 衣 霉 菌 （Byssochlamys nivea）ATCC22260、ATCC18742，純 黃 絲 衣 霉 （Byssochlamys fulva）ATCC24474、ATCC24008：北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司；

宛 氏 擬 青 霉 （Paecilomyces variotii）CICC4024、CICC4025：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；

宋內(nèi)志賀菌 （Shigella sonnei）ATCC25931、金黃色葡萄球菌 （Staphylococous aureus）ATCC6538、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）ATCC51329、福 氏 志 賀 氏 菌（Shigella flexneri）ATCC12022、 溶 血 性 鏈 球 菌（Streptococcus hemolyticus）CMCC32210、大 腸 埃 希 氏 菌（Escherichia coli）ATCC25922：上 海 漢 尼 生 物 技 術(shù) 有 限公司。

1.1.2 主要儀器

高速離心機(jī)：Microfuge 16型，貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司；

電子天平：AL204型，梅特勒－托利多（儀器）上海有限公司；

實(shí)時(shí)熒光PCR儀：7300型，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.1.3 主要試劑

Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒：杭州博日科技有限公司；

PCR反應(yīng)緩沖液（10×）（Mg2＋free）、MgCl2、dNTP（三磷酸脫氧核糖核苷）混合物、DNA聚合酶：寶生物工程（大連）有限公司；

ROX染料：上海位點(diǎn)生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 費(fèi)氏新薩托菌在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～6d（25℃），觀察有菌絲體或菌絲球形成，挑出，以備提取DNA使用。

1.2.2 模板DNA提取 將1.2.1中制備的菌絲體參照Biospin真菌基因組DNA抽提試劑盒說明進(jìn)行操作處理，提取真菌DNA模板。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 費(fèi)氏新薩托菌引物設(shè)計(jì)參考KACC41668beta－tubulin的部分基因序列。利用PrimerExpressTM（V3.0，美國(guó)ABI公司）軟件分析和設(shè)計(jì)引物和Taq－Man探針位點(diǎn)，序列見表1。引物和探針由Invitrogen公司合成。

表1 引物與Taqman探針序列Table 1 Specific primer and Taqman probe sequences

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

（1）實(shí) 時(shí) 熒 光 PCR 反 應(yīng) 條 件：95 ℃ （3min），95 ℃（15s）、59℃（40s）、40個(gè)循環(huán)。

（2）實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系按表2初始體系組成開始優(yōu)化，依次優(yōu)化ROX染料、Mg2＋、DNA聚合酶、dNTP混合物的用量。

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系組成Table 2 Real－time PCR reaction system

1.2.5 特異性試驗(yàn) 分別應(yīng)用1.1.1中顯示的費(fèi)氏新薩托菌、雪白絲衣霉菌、純黃絲衣霉菌、宛氏擬青霉菌和多株非耐熱霉菌，提取DNA后，按試驗(yàn)優(yōu)化的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，驗(yàn)證費(fèi)氏新薩托菌檢測(cè)的特異性。

1.2.6 靈敏度試驗(yàn) 以費(fèi)氏新薩托菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC66640為參考菌株，提取 DNA，提取液（57ng／μL）進(jìn)行10倍梯度稀釋，使 DNA 濃度約為101，100，10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，10－7ng／μL，應(yīng)用以上 DNA 按優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)，觀察結(jié)果，考察靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR體系中探針的適用性和ROX染料用量選擇

采用7300型PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)時(shí)，通常在反應(yīng)體系中添加ROX熒光染料，用以校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差等，提供一個(gè)穩(wěn)定的基線。

圖1顯示出不同ROX用量對(duì)費(fèi)氏新薩托菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響不同。0.8～2.0μL ROX的PCR體系均呈對(duì)數(shù)曲線擴(kuò)增，0.8μL用量的曲線1不夠平滑，綜合考慮，選取1.2μL ROX用量作為以后試驗(yàn)中費(fèi)氏新薩托菌實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增用量。

2.2 PCR體系中 Mg2＋濃度的選擇

Mg2＋是影響Taq酶活性的關(guān)鍵因素，Mg2＋濃度過高，會(huì)增加非特異性擴(kuò)增；Mg2＋濃度過低，影響Taq酶發(fā)揮最佳活性。因此，PCR反應(yīng)體系中Mg2＋濃度的選擇至關(guān)重要。

圖2顯示了Mg2＋濃度對(duì)費(fèi)氏新薩托菌實(shí)時(shí)熒光PCR的影響，當(dāng) Mg2＋的用量為0.5，1.0μL時(shí)，均未出現(xiàn)對(duì)數(shù)擴(kuò)增的曲線，說明PCR體系中Mg2＋濃度過低，影響了PCR擴(kuò)增的正常進(jìn)行。由圖2可知，費(fèi)氏新薩托菌適宜的Mg2＋用量在1.5～3.5μL。綜合考慮，2.5μL Mg2＋用量作為費(fèi)氏新薩托菌以后PCR試驗(yàn)的用量。

圖1 不同ROX用量對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增影響Figure 1 Effect of ROX concentration on real－time PCR amplification

圖2 Mg2＋濃度對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增影響Figure 2 Effect of Mg2＋ concentration on real－time PCR amplification

2.3 PCR體系中DNA聚合酶用量的選擇

DNA聚合酶是以DNA為復(fù)制模板，將DNA由5＇端點(diǎn)開始復(fù)制到3＇端的酶。DNA聚合酶是DNA片段擴(kuò)增的關(guān)鍵物質(zhì)。圖3顯示了不同的DNA聚合酶用量對(duì)費(fèi)氏新薩托菌實(shí)時(shí)熒光PCR的影響，當(dāng)酶的用量在0.2～0.6μL時(shí)，獲得了良好的對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，并且不同酶用量的熒光強(qiáng)度差別不大。因此，認(rèn)為PCR反應(yīng)體系中0.2μL的用量即可滿足實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增需求。

2.4 PCR體系中dNTP用量的選擇

dNTP又叫三磷酸脫氧核糖核苷，dNTP混合液是三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的摩爾比為1∶1∶1∶1的混合物，是構(gòu)成DNA鏈的基本組成物質(zhì)。

dNTP過少，影響PCR擴(kuò)增效率；過量，dNTP可與Mg2＋結(jié)合，從而降低體系中Mg2＋濃度，造成Taq聚合酶活性下降。圖4中費(fèi)氏新薩托菌在dNTP用量為2.0，3.0，4.0μL時(shí)的PCR擴(kuò)增效率較好，熒光信號(hào)的強(qiáng)度較高。為既滿足試驗(yàn)需求又節(jié)約成本，以2.0μL為后續(xù)PCR試驗(yàn)用量。

圖3 DNA聚合酶用量對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增影響Figure 3 Effect of DNA polymerase concentration on real－time PCR amplification

圖4 dNTP用量對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增影響Figure 4 Effect of dNTP concentration on real－time PCR amplification

綜上所述，經(jīng)過優(yōu)化后費(fèi)氏新薩托菌的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系組成見表3。

2.5 特異性

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)費(fèi)氏新薩托菌特異性的擴(kuò)增結(jié)果見圖5。圖5顯示該菌的引物和探針只對(duì)費(fèi)氏新薩托菌（ATCC66640、ATCC66641）產(chǎn)生擴(kuò)增，而對(duì)其他非費(fèi)氏新薩托菌均無交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.6 靈敏度

對(duì)費(fèi)氏新薩托菌的DNA提取物進(jìn)行10倍梯度稀釋后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果見圖6。費(fèi)氏新薩托菌最低8.6×10－4ng／反應(yīng)體系的DNA能夠被擴(kuò)增；其他更低的稀釋度沒有信號(hào)增長(zhǎng)。

3 討論

費(fèi)氏新薩托菌是人畜共患的致病菌，易污染果蔬汁而引起產(chǎn)品變質(zhì)，脹罐胖聽。本試驗(yàn)根據(jù)Genbank公布的betatubulin基因序列，設(shè)計(jì)了特異性引物和Taqman探針，建立了費(fèi)氏新薩托菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。與前人所建的費(fèi)氏新薩托菌PCR檢測(cè)方法［10，11］相比，該方法利用熒光探針通過實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目的基因的擴(kuò)增，整個(gè)檢測(cè)過程為完全閉管狀態(tài)，避免了污染；同時(shí)，無需電泳等PCR后處理過程，快速、準(zhǔn)確。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中ROX染料、Mg2＋濃度、DNA聚合酶和dNTP用量等，對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的正常進(jìn)行均有一定的影響，通過各梯度試驗(yàn)確定，25μL的反應(yīng)體系中，1.2μL ROX 染料（10μΜ）、2.5μL MgCl2（25mM）、0.2μL DNA 聚合酶（5U／μL）、2.0μL dNTP混合物（2.5mM）、2.5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液為適用于費(fèi)氏新薩托菌擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系，基因組DNA的靈敏度為8.6×10－4ng／反應(yīng)體系，方法特異性較好。該方法的建立為耐熱霉菌費(fèi)氏新薩托菌的快速檢測(cè)提供了新思路。

表3 優(yōu)化后的費(fèi)氏新薩托菌實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系Table 3 The optimal real－time PCR system

圖5 費(fèi)氏新薩托菌的特異性Figure 5 Specificity of real－time PCR for Neosartoryafescheri

圖6 費(fèi)氏新薩托菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度Figure 6 Sensitivity of real－time PCR for Neosartoryafescheri

1 Nielsen P V，Beuchat L R，F(xiàn)risvad J C.Growth of and fumitremorgin production by Neosartoryafischeri as affected by temperature，light，and water activity［J］.Appl.Environ.Microbiol.，1988，54（6）：1 504～1 510.

2 郭偉鵬，吳清平，張菊梅，等.果汁飲料中耐熱霉菌的分離和鑒定研究［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2008（增刊）：244～247.

3 祝紅昆.耐熱性霉菌引起果蔬汁飲料腐敗問題的實(shí)驗(yàn)探討［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，30（S1）：359～362.

4 郝天婷，周幗萍.2例果汁飲料中污染真菌的鑒定分析［J］.中國(guó)釀造，2010（9）：155～157.

5 Tournas V.Heat－resistant fungi of importance to the food and beverage industry［J］.Crit Rev Microbiol，1994，20（4）：243～263.

6 Summerbell R C，L de Repentigny，C Chartrand，et al.Graftrelated endocarditis caused by Neosartoryafischeri var.spinosa.［J］.J.Clin.Microbiol.，1992，30（6）：1 580～1 582.

7 Girardin H，Monod M，Latge J.Molecular characterization of the food－borne fungus Neosartoryafischeri （Malloch and Cain）［J］.Appl.Environ.Microbiol.，1995，61（4）：1 378～1 383.

8 Silva F V，Gibbs P.Target selection in designing pasteurization processes for shelf－stable high－acid fruit products［J］.Crit Rev Food Sci.Nutr.，2004，44（5）：353～360.

9 張慧，鄭曉冬，姜侃，等.PCR快速檢測(cè)耐熱霉菌雪白絲衣霉菌［J］.食品與機(jī)械，2012，28（6）：96～98.

10 Lau A，Chen S，Sorrell T，et al，Development and clinical application of a panfungal PCR assay to detect and identify fungal DNA in tissue specimens［J］.J.Clin.Microbiol.，2007，45（2）：380～385.

11 Emmanuelle C N T，Robert A.Method for detecting heat－resistant micro－organisms capable of contaminating certain food products：United States，6117636［P］.2000－09－12.