衛(wèi)靜莉，薛笑莉，陳玉章

（太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，山西太原 030008）

提取柿葉黃酮類化合物工藝研究

衛(wèi)靜莉，薛笑莉，陳玉章

（太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，山西太原 030008）

摘 要：研究3種不同浸取柿葉黃酮類物質(zhì)的工藝方法及優(yōu)化工藝參數(shù)，通過正交試驗(yàn)，得出超聲波水提法、超聲波溶劑提取法和微波溶劑提取法的最佳工藝條件，3種方法在最佳工藝條件下的黃酮類物質(zhì)提取量依次為5.28%、6.19%和6.15%；超聲波水提法經(jīng)濟(jì)適用，適合生產(chǎn)化，超聲波溶劑提取法和微波溶劑提取法所得提取黃酮類物質(zhì)較高，比超聲波水提法高出約0.8%。

關(guān)鍵詞：柿葉；黃酮類物質(zhì)；超聲；微波；正交試驗(yàn)

柿葉中含有黃酮類、VC、三萜類、有機(jī)酸類、香豆素類、生物堿等多種生理活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等作用。因此，對(duì)柿葉中的黃酮類成分進(jìn)行提取分離研究具有較大實(shí)用價(jià)值。我國地域遼闊，有著大量的柿葉資源，對(duì)柿葉進(jìn)行綜合開發(fā)利用，從中提取分離出黃酮類化合物以造福于人類，具有廣闊的市場(chǎng)前景[1-2]。

對(duì)于從植物中提取有效成分有不同方法，不同提取工藝所得其黃酮類物質(zhì)提取量、經(jīng)濟(jì)效益不同。本文通過對(duì)超聲波水提法、超聲波溶劑提取法、微波溶劑提取法進(jìn)行研究比較，以總黃酮提取量為指標(biāo)，分別采用單因素考察和正交試驗(yàn),得出經(jīng)濟(jì)、適宜的柿葉黃酮類物質(zhì)的提取方法及工藝,為柿葉的經(jīng)濟(jì)開發(fā)以提供技術(shù)支持。

1 儀器、材料與試劑

1.1 主要儀器

高效液相色譜儀[P－1201泵、UV－1201紫外檢測(cè)器（有內(nèi)置工作站）、SP自動(dòng)進(jìn)樣器]：大連依科特公司；KQ-2200DB數(shù)控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市英峪予華儀器廠制造；722型可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司制造；WP700（MS-2014T）LG微波爐：樂金電子天津電器有限公司制造；循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 材料與試劑

柿葉：采自山西運(yùn)城地區(qū)八月新鮮柿葉,自然涼干,粉碎備用；蘆丁對(duì)照品：中國藥品生物制品鑒定所；95%乙醇：天津北辰方正試劑廠；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 分光光度法測(cè)定柿葉中總黃酮含量

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備與測(cè)定

精密稱取于105℃下烘至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑10 mg，用60%（體積比）乙醇溶解，用60%乙醇定容至50 mL容量瓶中，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 于 6 支 25mL 容量瓶中，加入1 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，放置5 min后加入1 mL 10%Al（NO3）3溶液，搖勻，放置6 min后再加入10 mL1mol/LNaOH溶液，搖勻用去離子水補(bǔ)足至刻度，放置15 min后在510 nm處（實(shí)驗(yàn)測(cè)得的最大吸收波長(zhǎng)）測(cè)定其吸光值，用空白試劑作參比。以蘆丁濃度對(duì)吸光值作圖，蘆丁溶液在0.017 9 mg/mL～0.044 8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999 4），蘆丁溶液濃度和吸光度的回歸方程為：C=0.107 9A-0.000 08，式中：C為蘆丁濃度，（mg/mL）；A 為吸光度。

2.1.2 提取液總黃酮含量的測(cè)定

取待測(cè)液1mL，于25mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min后加入1%Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，放置6 min后加入4%NaOH溶液10 mL，搖勻，用60%乙醇定容，15 min后于510 nm處測(cè)定吸光度A。將所得的吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，可計(jì)算得提取液中總黃酮濃度[3]。

2.2 HPLC法測(cè)定柿葉中總黃酮含量

2.2.1 色譜條件的選擇

色譜柱：HypersiIBDs C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）流動(dòng)相：甲醇-水（體積比 50∶50）；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm，流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品4.3 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，然后分別配成 0.016、0.032、0.048、0.064 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量品中，進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，平均峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=4 145.6X+3.585，蘆丁溶液在0.016 mg/mL～0.064 mg/mL范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系（R2=0.999 1），式中：X為蘆丁濃度，（mg/mL），Y為吸光度。

2.3 方法

2.3.1 超聲波水提法

稱取3 g（精確到0.001 g）經(jīng)干燥、粉碎、過篩的柿葉，加入pH為11的堿水100 mL浸泡一定時(shí)間后，在一定的超聲波功率下，提取一定時(shí)間后過濾，用少量乙醇洗滌濾渣，合并濾液，稀釋一定倍數(shù)后按照2.1.2顯色法對(duì)待測(cè)液進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果以每克干柿葉中所含目標(biāo)成分的毫克數(shù)來表示總黃酮提取量[4]。

2.3.2 超聲波溶劑提取法

準(zhǔn)確稱取2 g柿葉粉，用70%的乙醇作溶劑，按照一定配料比，確定加入乙醇的量，在一定的超聲波功率下萃取一定時(shí)間，過濾后，用原提取劑定容于100 mL容量瓶中，作為待測(cè)液。按照2.1.2顯色法測(cè)定浸取液吸光度值，計(jì)算提取液中總黃酮提取量。

2.3.3 微波溶劑提取法

稱取一定量干燥的柿葉粉末，加入一定濃度體積量的乙醇作溶劑于錐形瓶中，在設(shè)定的微波功率下加熱一定時(shí)間，取出冷卻至室溫，過濾，得到浸取的待測(cè)液，按照2.1.2顯色法測(cè)定浸取液吸光度值，計(jì)算提取液中總黃酮提取量。

3 結(jié)果與分析

分別按照2.3.1、2.3.2、2.3.3的試驗(yàn)方法，通過單因素影響的考察，確定各種方法的因素水平表，然后進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定相應(yīng)方法的最佳提取條件。

3.1 超聲波水提法

3.1.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1.1 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

按照2.3.1方法操作，改變提取時(shí)間20min～60min，結(jié)果見圖1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)提取量的影響Fig.1 The extracting time on the extraction rate of flavonoids influence

由圖1可知，超聲作用時(shí)間越長(zhǎng)，提取物中黃酮含量越高。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的增長(zhǎng)，超聲波對(duì)樣品細(xì)胞膜的破壞程度增加。因此隨著時(shí)間增加，膜破壞程度加強(qiáng)，溶出物增多，黃酮含量增加。隨著時(shí)間進(jìn)一步增加，膜被破壞，溶解的雜質(zhì)進(jìn)一步增加，有效成分溶解量減少，黃酮含量增加不明顯[5]，故選擇30 min～50 min的范圍來優(yōu)化提取時(shí)間。

3.1.1.2 提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響

按照2.3.1方法操作，改變提取溫度20℃～60℃，考察其對(duì)提取量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取溫度對(duì)提取量的影響Fig.2 The extracting temperature on flavonoids extraction rate influence

由圖2可知，隨著超升溫度的升高，總黃酮得率增大，到40℃時(shí)有最大值，再升高溫度得率下降，這可能是因?yàn)辄S酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)易被高溫破壞。綜合考慮，選擇30℃～50℃的范圍來優(yōu)化溫度這個(gè)參數(shù)。

3.1.1.3 浸泡時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

按照2.3.1方法操作，改變物料浸泡時(shí)間5 h～48 h，考察不同浸泡時(shí)間對(duì)提取量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 浸泡時(shí)間對(duì)提取量的影響Fig.3 Soak time on flavonoids extraction rate influence

由圖3可知，隨著浸泡原料時(shí)間的增加，黃酮提取量不斷增大，但超過6 h之后增大幅度變小，浸泡12 h后基本無變化。選擇6 h～24 h范圍來優(yōu)化浸泡時(shí)間參數(shù)。

3.1.1.4 溶劑用量對(duì)總黃酮提取量的影響

按照2.3.1方法操作，改變?nèi)軇┝浚疾炱鋵?duì)提取量的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，提取量隨溶劑量的增加而增大，這是因?yàn)槿軇┯昧吭酱?，有效成分從植物組織內(nèi)到溶液間的濃度差就越大，越有利于傳質(zhì)的進(jìn)行，但溶劑用量達(dá)到一定程度后提取量增加緩慢[6]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取溶劑量為30 mL～90 mL范圍來優(yōu)化溶劑量。

3.1.2 超聲水提法正交試驗(yàn)與結(jié)果討論

圖4 溶劑用量對(duì)提取量的影響Fig.4 Material liquid ratio on flavonoids extraction rate influence

在初步單因素的基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間、溫度、浸泡時(shí)間、溶劑量4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1 四因素三水平表Table 1 Four factors and three levels test table

以柿葉總黃酮提取量為考察指標(biāo)，選用L9（34）對(duì)柿葉總黃酮提取工藝進(jìn)行研究。正交設(shè)計(jì)及正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果見表2。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及極差分析結(jié)果Table 2L9（34）Results and date analysis of orthogonal design

從正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果可以看出，在超聲波堿水提取的條件下，各個(gè)因素對(duì)總黃酮提取量的影響大小為：溶劑量＞提取時(shí)間＞浸泡時(shí)間＞超聲溫度，由位級(jí)計(jì)算值K分析得最優(yōu)方案是：A2B1C3D3，在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)，提取溫度40℃，浸泡時(shí)間為6 h，提取時(shí)間為50 min，溶劑用量90 mL，所得總黃酮提取量為5.25%。而由直接觀察試驗(yàn)結(jié)果得最優(yōu)方案為A2B1C2D3，此方案下總黃酮提取量為5.28%。根據(jù)單因素試驗(yàn)情況，提取時(shí)間（C因素）對(duì)提取率的影響趨勢(shì)如圖1所示，C2（40 min）和C3（50 min）對(duì)結(jié)果帶來的影響差別很小，且采用C2條件經(jīng)濟(jì)，同時(shí)A2B1C2D3方案提取率高，故確定最佳提取工藝條件為：A2B1C2D3。在該條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，即提取溫度40℃，浸泡時(shí)間為6 h，提取時(shí)間為40 min，溶劑用量90 mL，所得總黃酮平均提取率為5.281%。

3．2 超聲波溶劑提取法結(jié)果[1]

按照2.3.2方法，經(jīng)試驗(yàn)考察，選用超聲波功率、萃取時(shí)間和料液比作為3因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以全面研究這3個(gè)因素的交叉作用對(duì)柿葉總黃酮得率的影響。由正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析可知，各因素對(duì)黃酮得率影響的主次順序?yàn)椋篈＞B＞C，即萃取時(shí)間＞超聲波功率＞料液比。最后確定最佳萃取條件為：A2B3C1，即料液比為1∶20，超聲波功率為220 W，萃取時(shí)間為40 min。由于最佳的萃取條件在正交試驗(yàn)中為出現(xiàn)過，所以需進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在該最佳條件下重復(fù)3次萃取實(shí)驗(yàn)，得到總黃酮的平均提取量為6.19%。

3.3 微波溶劑提取法結(jié)果[5]

按照2.3.3方法，經(jīng)試驗(yàn)考察，各因素對(duì)黃酮類化合物浸取量影響的主次順序?yàn)锽＞C＞D＞A，即：料液比＞處理時(shí)間＞乙醇濃度＞微波功率。最佳實(shí)驗(yàn)工藝條件為：A3B4C2D1。即微波功率為420 W，料液比為1∶25，處理時(shí)間為2 min，乙醇濃度為65%。此時(shí)，提取量為6.15%。

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，測(cè)得黃酮類化合物平均提取量為6.11%。由此可知，微波輔助法提取柿葉中黃酮類化合物重復(fù)性良好。

4 結(jié)論

和HPLC法結(jié)合，在考察單本研究采用分光光度法因素影響和正交實(shí)驗(yàn)時(shí)采用了分光光度法，在考察最佳工藝條件時(shí)采用HPLC法，縮短了分析時(shí)間，最終含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

用超聲水提法的最佳工藝條件為：超聲處理時(shí)間40 min，溫度40℃，溶劑量90 mL，浸泡時(shí)間為6 h，所得黃酮物質(zhì)含量為5.25%；用超聲溶劑提取法的最佳工藝條件為：溶劑量1∶20，超聲波功率220 W，萃取時(shí)間40 min。得到總黃酮的平均提取量為6.19%；用微波溶劑提取法的最佳工藝條件為：微波功率420 W，料液比1∶25，處理時(shí)間2 min，乙醇濃度65%。提取量為6.15%。3種方法相比較，從總黃酮提取量比較，超聲波溶劑法和微波溶劑法較高，比超聲波水提法高出0.8%，從經(jīng)濟(jì)方面比較，超聲波水提法雖然提取量稍低，但無需消耗大量溶劑，同時(shí)可省去溶劑回收的投資。綜合兩方面因素，如要進(jìn)行生產(chǎn)投資，應(yīng)采用超聲波水提法更適合。

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[1]衛(wèi)靜莉，高松平,張火利,等.超聲波輔助提取柿葉黃酮類化合物研究[C]//第九屆全國中藥和天然藥物學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集,2007,548-552

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Extraction of Flavonoids from Persimmon Leaves Process Research

WEI Jing-li，XUE Xiao-li，CHEN Yu-zhang
（Dept.ofChemistryandChemicalEngineering，TaiyuanInstitute of Technology，Taiyuan030008，Shanxi，China）

Abstract：Studied three kinds of persimmon leaf flavones extraction process and process parameters， through the orthogonal experiment， the ultrasonic water extraction， ultrasonic solvent extraction and microwave extraction method of the optimum process conditions.showed that：three methods in optimum conditions of flavonoids extraction rate were 5.28%，6.19%and 6.15%；ultrasonic water extraction method is economical and practical， suitable for the production， ultrasonic solvent extraction method and microwave solvent extraction method of extracting flavone substance is higher than water extraction，ultrasonic wave of about 0.8%higher.

Key words：Persimmon leaves；flavonoids；ultrasonic；microwave；orthogonal factoral design

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.008

山西省科技研究開發(fā)項(xiàng)目“從柿葉中提取黃酮化合物的研究”（編號(hào):2007156）

衛(wèi)靜莉（1957—），女（漢），教授,碩士生導(dǎo)師，本科，研究方向：植物中有效成分提取分離純化、化工過程與工藝等。

2012-10-21