肖海峻，孟利前，楊新建，董正陽(yáng)，張猛

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京 102442）

苜蓿葉蛋白脫色脫腥最佳工藝參數(shù)的研究

肖海峻，孟利前，楊新建，董正陽(yáng)，張猛

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京 102442）

摘 要：以無(wú)水乙醇為浸提劑，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)研究浸提溫度、浸提級(jí)數(shù)、浸提時(shí)間及浸提料液比對(duì)苜蓿葉蛋白脫色、脫腥效果的影響；在此基礎(chǔ)上采用四因素三水平正交試驗(yàn)對(duì)苜蓿葉蛋白脫色、脫腥最佳工藝進(jìn)行優(yōu)化，研究結(jié)果表明：影響因素的主次順序?yàn)榻峒?jí)數(shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間及浸提料液比；其最佳工藝條件為浸提料液比為1∶8 g/mL，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間7 h，浸提級(jí)數(shù)2級(jí)。該研究旨在使苜蓿葉蛋白成為植物性蛋白源。

關(guān)鍵詞：苜蓿；葉蛋白；脫色；脫腥

葉蛋白泛指以新鮮的青嫩莖葉為原料，經(jīng)榨汁、絮凝、濃縮、干燥等工藝提取的一種富含蛋白質(zhì)的濃縮物（leaf protein concentration 簡(jiǎn)稱 LPC）[1]，目前用于生產(chǎn)LPC的原料主要是苜蓿，苜蓿葉蛋白中氨基酸種類齊全且組成比例較為平衡，與聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的成人氨基酸模式基本相符，可作為兒童和成人的食用蛋白源和食品添加劑[2]。但在提取過(guò)程中苜蓿葉蛋白帶有很深的綠色和青草味，從視覺(jué)和味覺(jué)上使人難于接受，嚴(yán)重限制苜蓿葉蛋白在食品中的應(yīng)用。本文擬對(duì)苜蓿葉蛋白脫色脫腥最佳方案進(jìn)行研究，使其成為植物性食品蛋白源，這對(duì)進(jìn)一步提高和改善人們膳食結(jié)構(gòu)將具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

苜蓿葉蛋白來(lái)源于本項(xiàng)目前期提取獲得的產(chǎn)品。

1.2 儀器

FA-2004N電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；A-88組織搗碎勻漿機(jī)：金壇市醫(yī)療儀器廠；LD4-2低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；pHS-3C酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SM-3X恒溫干燥箱：上海神模電氣有限公司；8002型恒溫水浴鍋：北京光明醫(yī)療機(jī)械廠；T6紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KDY-9830全自動(dòng)凱氏定氮儀：北京市通潤(rùn)源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苜蓿葉蛋白脫色脫腥工藝流程

在初花期采摘苜蓿葉片，用打漿機(jī)打漿，打漿原料與水比為1 mg：5 mL，加鹽量為2.2%，打漿時(shí)間為5 min，漿液用4層紗布過(guò)濾，調(diào)漿液pH為3，在80℃條件下加熱8 min進(jìn)行絮凝。在絮凝的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將其離心10 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，去除上清液，將沉淀物在常溫條件下自然干燥即得濃縮葉蛋白。將葉蛋白以120目篩粉碎，準(zhǔn)確稱取苜蓿葉蛋白2.000 g，選用不同的浸提劑、浸提溫度、浸提料液比和浸提時(shí)間浸提葉蛋白，然后利用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定浸提液在649、665 nm波長(zhǎng)條件下的吸光度并感官評(píng)價(jià)沉淀物的顏色和氣味，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)獲得葉蛋白脫色脫腥最佳工藝參數(shù)[4-6]。

1.3.2 苜蓿葉蛋白脫色脫腥工藝流程考核指標(biāo)

吸光度測(cè)定：用T6型紫外分光光度計(jì)測(cè)定浸提液在波長(zhǎng)為649、665 nm下的吸光度并計(jì)算葉綠素含量，具體公式如下[7]：

葉綠素總含量（mg/g）：葉綠素a含量+葉綠素b含量

蛋白質(zhì)提取率測(cè)定：凱氏定氮法

顏色、氣味評(píng)價(jià)：感官評(píng)定法。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

浸提試劑的確定：準(zhǔn)確稱取苜蓿葉蛋白2.000 g，按照液固比為5 mL∶1 g分別加入丙酮、95%乙醇、無(wú)水乙醇，在溫度為50℃的條件下浸提5 h，離心并測(cè)定浸提液的葉綠色含量；對(duì)沉淀物進(jìn)行感官評(píng)定并用凱氏定氮法測(cè)定其粗蛋白含量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

浸提溫度的確定：準(zhǔn)確稱取苜蓿葉蛋白2.000 g，加 30 mL 無(wú)水乙醇，分別在 30、40、50、60、70 ℃浸提5 h，離心并測(cè)定浸提液的葉綠色含量；對(duì)沉淀物進(jìn)行感官評(píng)定并測(cè)定其粗蛋白含量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

浸提時(shí)間的確定：準(zhǔn)確稱取苜蓿葉蛋白2.000 g，將苜蓿葉蛋白在60℃溫度條件下，加30 mL無(wú)水乙醇，將苜蓿蛋白分別浸提 3、4、5、6、7、8 h，離心并測(cè)定浸提液的葉綠色含量；對(duì)沉淀物進(jìn)行感官評(píng)定并測(cè)定其粗蛋白含量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

浸提料液比的確定：準(zhǔn)確稱取苜蓿葉蛋白2.000 g，將苜蓿葉蛋白在溫度為60℃、料液比分別為 1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10 g/mL 的條件下浸提 5 h，離心并測(cè)定浸提液的葉綠色含量；對(duì)沉淀物進(jìn)行感官評(píng)定并用凱氏定氮法測(cè)定其粗蛋白含量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4.2 正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)因素為料液比、浸提溫度、浸提級(jí)數(shù)和浸提時(shí)間的四因素三水平正交試驗(yàn)以獲得苜蓿葉蛋白脫色、脫腥的最佳工藝參數(shù)，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 苜蓿葉蛋白正交試驗(yàn)因素水平表[L9（33）]Table 1 4 Factors and 3 Levels of orthogonal test designs table of LPC for decolouration and deodorization

2 討論與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 不同浸提劑對(duì)脫色、脫腥效果的影響

利用不同溶劑浸提苜蓿葉蛋白，葉蛋白脫色脫腥效果的感官評(píng)價(jià)見(jiàn)表2，測(cè)定浸提液在649 nm和665 nm處的吸光度并計(jì)算葉綠素含量；利用凱氏定氮測(cè)定粗蛋白含量并計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測(cè)定結(jié)果如圖1。

表2 不同浸提劑對(duì)脫色、脫腥效果的感官評(píng)價(jià)Table 2 The sensory evaluation of decoloration and deodorization on different extractant

圖1 不同浸提劑對(duì)葉綠素含量和蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect on the contents of chlorophyll and leaf protein by different extractant

從表2可以看出，不同浸提劑對(duì)葉蛋白脫色脫腥效果的感官評(píng)價(jià)不一樣，三者相比較來(lái)看，經(jīng)無(wú)水乙醇處理獲得葉蛋白顏色最淺，腥味最淡。

從圖1也可以看出，經(jīng)無(wú)水乙醇處理后的浸提液其葉綠素含量達(dá)到最高，這個(gè)結(jié)論也可證實(shí)了感官評(píng)價(jià)的結(jié)果。此外，不同浸提劑對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響較大，本研究中利用無(wú)水乙醇獲得蛋白質(zhì)提取率較高。綜合以上分析，本研究結(jié)果認(rèn)為無(wú)水乙醇是葉蛋白脫色脫腥的最佳浸提劑。

2.1.2 不同浸提溫度對(duì)脫色、脫腥效果的影響

在不同溫度條件下浸提葉蛋白其沉淀物的感官評(píng)價(jià)見(jiàn)表3，測(cè)定浸提液在649 nm和665 nm處的吸光度并計(jì)算葉綠素含量；利用凱氏定氮測(cè)定粗蛋白并計(jì)算蛋白質(zhì)提取率其結(jié)果如圖2所示。

表3 不同溫度對(duì)脫色脫腥的感官評(píng)價(jià)Table 3 The sensory evaluation of decoloration and deodorization with different temperature

圖2 不同浸提溫度對(duì)葉綠素含量和蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect on the contents of chlorophyll and leaf protein by different extractant temperature

由表3可以看出，溫度在50℃～60℃范圍之內(nèi)葉蛋白脫色脫腥感官評(píng)價(jià)較好，顏色為淡綠色，草腥味較淡。

由圖2可以看出，在溫度范圍為30℃～60℃之內(nèi)，隨著浸提溫度的升高，葉綠素的含量增加，且到60℃時(shí)含量達(dá)到最高，原因在于隨著溫度的提高，溶劑向原料內(nèi)部的擴(kuò)散速率增加，溶質(zhì)的溶出速度加快。但超過(guò)60℃以后，葉綠素的含量會(huì)降低，含量降低的原因有可能是溫度超過(guò)一定范圍之后，葉綠素被高溫分解。

從蛋白質(zhì)提取率來(lái)看，蛋白質(zhì)提取率與溫度成正比，隨著溫度的升高蛋白質(zhì)提取率也不斷的提高。綜合以上分析，本研究認(rèn)為適宜的浸提溫度為60℃。

2.1.3 不同浸提液料比對(duì)脫色、脫腥效果的影響

對(duì)不同浸提料液比浸提后的沉淀物進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4，測(cè)定浸提液在649 nm和665 nm處的吸光度并計(jì)算葉綠素含量；利用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白并計(jì)算蛋白質(zhì)提取率，結(jié)果如圖3所示。

表4 不同浸提料液比對(duì)脫色脫腥效果感官評(píng)價(jià)Table 4 The sensory evaluation of decoloration and deodorization on different radio of absolute alcohol of leaf protein

從表4可以看出，不同浸提料液比對(duì)脫色脫腥感官效果不同，從表中可以看出，料液比為 1∶6、1∶8 和1∶10 g/mL時(shí)脫色脫腥感官效果比較好。

圖3 不同料液比對(duì)葉綠素含量和蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect on the contents of chlorophyll and leaf protein by the radio of absolute alcohol to leaf protein

從圖3可以看出，葉綠素含量和蛋白質(zhì)提取率隨著料液比的增加而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶8 g/mL時(shí)兩者的增幅開(kāi)始變的緩慢，本著節(jié)約成本的角度出發(fā)，本研究中選用料液比為1∶8 g/mL。

2.1.4 不同浸提時(shí)間對(duì)脫色、脫腥效果的影響

對(duì)不同浸提時(shí)間浸提后的沉淀物進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表5，測(cè)定浸提液在649 nm和665 nm處的吸光度并計(jì)算葉綠素含量；利用凱氏定氮測(cè)定粗蛋白并計(jì)算蛋白質(zhì)提取率，測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

表5 不同浸提時(shí)間對(duì)脫色脫腥的感官評(píng)價(jià)Table 5 The sensory evaluation of decoloration and deodorization on different extraction time

圖4 不同浸提時(shí)間對(duì)葉綠素含量和蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect on the contents of chlorophyll and leaf protein by different extractant tme

從表5可以看出，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，脫色脫腥的感官效果明顯，當(dāng)達(dá)到6 h以后，顏色和草腥味基本趨于平穩(wěn)。

從圖4可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠素含量和蛋白質(zhì)提取率在增加，當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)6 h后葉綠素含量和蛋白質(zhì)提取率增幅變小，增幅趨于平穩(wěn)，綜合考慮浸提效果，確定葉蛋白脫色脫腥的浸提時(shí)間6 h為適宜的浸提時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

以葉綠素含量為指標(biāo)對(duì)葉蛋白脫色脫腥工藝流程進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，以得到最佳提取工藝條件。

從表6、表7可以看出，4個(gè)因素對(duì)葉綠素含量均有顯著影響，因素主次順序?yàn)椋篋－A－B－C，對(duì)因素D、A、B、C再進(jìn)行分析，確定優(yōu)組合為D2A2B3C3，即脫色脫腥浸提級(jí)數(shù)為2級(jí)，浸提溫度為60℃，浸提時(shí)間為7 h，料液比為1∶8為最優(yōu)方案。而張澤生、趙希艷[3]研究的結(jié)果認(rèn)為是最佳料液比為1∶6 g/mL，浸提溫度為85℃，浸提時(shí)間為4 h，浸提級(jí)數(shù)為3級(jí)。筆者認(rèn)為兩者的料液比接近和影響葉蛋白脫色脫腥效果因素的排列順序是一致的，而浸提時(shí)間和浸提溫度之間存在較大差異，產(chǎn)生的原因可能與試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)方法有關(guān)。

表6 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 6 Experiment project and analysis results

表7 方差分析結(jié)果Table 7 Anova for chlorophyll content with various extraction condition

3 結(jié)論

苜蓿葉蛋白由于其呈墨綠色、草腥味重等限制其在食品業(yè)中的應(yīng)用。本研究選用丙酮、無(wú)水乙醇和95%的乙醇作為浸提劑，通過(guò)葉對(duì)葉蛋白氣味和顏色的感官評(píng)價(jià)以及葉綠素含量和蛋白質(zhì)提取率的測(cè)定研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)水乙醇是最佳的浸提劑。

以無(wú)水乙醇做為浸提劑，通過(guò)對(duì)浸提料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)對(duì)葉蛋白脫色脫腥方案進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)方案是浸提級(jí)數(shù)為2，浸提時(shí)間為7 h，浸提溫度為60℃，料液比為1∶8 g/mL。利用該工藝參數(shù)得到脫色脫腥的葉蛋白產(chǎn)品顏色為淺灰白色，草腥味很淡，蛋白質(zhì)提取率達(dá)52.3%。

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Experimental Study on Parameter Optimization for Leave Protein Concentration of Decolouration and Deodorization

XIAO Hai-jun，MENG Li-qian，YANG Xin-jian,DONG Zheng-yang，ZHANG Meng
（Department of Food and Bioengineering，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442，China）

Abstract：Using absolute alcohol as extractant， the extraction effects on leaf protein of decolouration and deodorization are studied with different conditions such as extraction temperature， extraction time， extraction times and the radio of absolute alcohol to leaf protein.Based on the single factor experiment，the orthogonal experiment 4 factors and 3 levels were used to research the optimal processing parameters on leaf protein of decolouration and deodorization.The results showed that the order of main factors as follows： extraction times，extraction temperature，extraction time and the radio of absolute alcohol to leaf protein；the optimal processing parameters as follows： the radio of absolute alcohol to leaf protein is 8∶1 mL/g with 60 ℃ for 7 hours with 2 times.The aim of this paper can provide possibility which leaf protein will be used as food additive in future.

Key words：Alfalfa；leaf protein；decolourization；deodorization

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.020

北京市教委科技計(jì)劃面上項(xiàng)目（KM200900005007）-苜蓿葉蛋白提取技術(shù)研究

肖海峻（1966—），女（漢），教授，博士，研究方向：牧草種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)與利用。

2012－10－01