張 鵬，廉江平，方志遠，李小川

酮咯酸氨丁三醇為非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥，屬于吡咯烷羧酸衍生物。本品經(jīng)口服或注射被人體吸收后轉(zhuǎn)化成酮咯酸發(fā)揮其抗炎鎮(zhèn)痛作用，因其具有抑制花生四烯酸或膠原誘發(fā)的血小板聚集作用，故與其他非甾體抗炎藥物的作用機制類似。酮咯酸氨丁三醇的鎮(zhèn)痛活性較強，能有效緩解各類軟組織、肌肉以及關(guān)節(jié)的中度疼痛。因其兼具迅速強效、非成癮、非麻醉性等優(yōu)勢，故在臨床上應(yīng)用廣泛［1-2］。國內(nèi)外目前對酮咯酸氨丁三醇的注射劑、普通片劑、膠囊劑、滴眼劑等應(yīng)用研究較多，但酮咯酸氨丁三醇分散片作為一種新劑型，具有較其他口服制劑吸收迅速、快速起效，較注射劑使用方便、快捷的特點。目前國內(nèi)還沒有對酮咯酸氨丁三醇分散片進行生物等效性評價的研究［3］。本研究建立了RP-HPLC法測定人血漿中酮咯酸氨丁三醇的濃度，通過比較健康志愿者分別口服分散片與膠囊劑后的藥代動力學(xué)特點，評價兩者的生物等效性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-10ATvp高效液相色譜儀(包括2010A自動進樣器，SPD-M10Avp二極管陣列檢測器，LCsolution色譜工作站，島津公司);AS3120A超聲震蕩器(奧特賽恩斯公司);TEX-6渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);PHS-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠);IDL-5-A冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 藥品與試劑 酮咯酸氨丁三醇分散片(受試制劑，10 mg/片，批號:070601);酮咯酸氨丁三醇膠囊(參比制劑，10 mg/粒，批號:070601);酮咯酸氨丁三醇對照品(純度99.8%，批號:061101)均由山東新時代藥業(yè)有限公司提供;空白人血漿(西安市中心血站);甲醇(色譜純，TEDIA公司)，硫酸、氫氧化鈉、磷酸、磷酸二氫鉀、正己烷、乙醚等均為分析純，蒸餾水為雙蒸水。

2 方法

2.1 受試對象 臨床試驗方案經(jīng)過我院倫理委員會審查批準。選擇健康成年男性志愿者進行全面的體格檢查，對肝、腎功能項目進行化驗，并進行心電圖、血壓等檢查。18名志愿者年齡為(22.1±1.5)歲，身高為(173.3±3.2)cm，體重(66.2±5.8)kg，在標準體重的±10%之內(nèi)，體檢結(jié)果正常，無藥物過敏史及既往病史，精神狀態(tài)良好。受試者在試驗前簽署知情同意書，并在試驗前2周內(nèi)未服用其他藥物。受試期間禁煙、酒、茶，清淡飲食，并限制其進行劇烈活動。

2.2 試驗設(shè)計與血樣采集 采用雙周期、自身交叉單次服藥的對照試驗設(shè)計。隨機將18例受試者分為人數(shù)相等的兩組。在試驗前一日晚入院禁食12 h后，于翌日清晨8∶00空腹用220 mL溫開水送服參比制劑或受試制劑20 mg，服藥后2 h方可飲水，在服藥后4 h和10 h進統(tǒng)一的低脂標準餐。醫(yī)師負責(zé)對受試者進行臨床監(jiān)護，藥學(xué)專業(yè)人員控制采血時間，護士負責(zé)采血工作。受試者分別于服藥前和服藥后 0.17、0.33、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0、24.0 h 采上肢靜脈血4 mL，加入到肝素抗凝的離心管中，室溫條件下靜置15 min后，冷凍離心機3 000 r/min離心10 min，傾出上層血漿，保存于-20℃冰箱中用于日后測定。經(jīng)過間隔7 d的清洗期后，兩組受試者交叉服用與上一周期不同的酮咯酸氨丁三醇制劑，并嚴格按照上述試驗設(shè)計的規(guī)定服藥及采血。

2.3 血藥濃度測定

2.3.1 血漿樣品的處理 待測血漿室溫融化，靜置10 min后，取具塞試管，加入血樣0.5 mL及0.6 mol/L硫酸溶液 200 μL，渦旋混勻;加入4.0 mL乙醚，渦旋振蕩，充分提取后，于4 500 r/min離心5 min，吸取上層2.5 mL有機層置尖底離心管中，于40℃恒溫水浴條件下氮氣吹干，吸取2 mL正己烷充分溶解管中殘留物，并精密加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液200 μL振蕩混合，于4 500 r/min離心5 min，分取水層，精密加入0.6 mol/L硫酸溶液50 μL，充分混勻，濾膜過濾后，取50 μL進樣測定。

2.3.2 色譜條件 色譜柱為Hypersil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm，Thermo Quest公司)，流動相為0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液(pH=2.5)-甲醇(55∶45);流速:1.0 mL/min;檢測波長為321 nm。柱溫:室溫。

2.3.3 方法的專屬性 按照“2.3.2”項下色譜條件，受試者的空白血漿樣品、標準品及用藥后的血漿色譜圖見圖1。酮咯酸氨丁三醇的保留時間約為10.1 min，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對酮咯酸氨丁三醇的測定無干擾。

圖1 HPLC法測定血漿中酮咯酸氨丁三醇的色譜圖

2.3.4 標準曲線與線性范圍 取空白血漿1.0 mL，加酮咯酸氨丁三醇標準系列溶液50 μL，配制成質(zhì)量濃度為 49.50、99.00、247.50、495.00、990.00、1 980.00和3 960.00 ng/mL的血漿系列標準溶液，按“2.3.2”項下操作，進樣 50 μL，記錄色譜圖。以藥物質(zhì)量濃度(C)為縱坐標、色譜峰面積(A)為橫坐標進行回歸計算，求得標準曲線方程為:C=0.005 9 A+5.29(n=7)，r=0.999 9，表明酮咯酸氨丁三醇血漿濃度在 49.50～3 960.00 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測濃度為49.50 ng/mL。

2.3.5 方法回收率和精密度 取空白血漿1.0 mL，按“2.3.4”項下方法配制酮咯酸氨丁三醇低、中、高3個質(zhì)量濃度(分別為 49.50、495.00、1 980.00 ng/mL)的血漿質(zhì)控樣品(n=5)，連續(xù)測定5 d，每日做一條隨行標準曲線，記錄色譜圖，將色譜峰面積代入到當(dāng)日隨行標準曲線中計算血漿質(zhì)控樣品的測得濃度，與配制濃度進行比較，計算該方法的日間和日內(nèi)精密度，數(shù)據(jù)見表1。

2.3.6 絕對回收率 取空白血漿1.0 mL，加入適量酮咯酸氨丁三醇標準溶液使血漿質(zhì)量濃度分別為 99.00、495.00、1 980.00 ng/mL，按血漿樣品的處理及血藥濃度測定方法進行測定，另取酮咯酸氨丁三醇標準溶液，不經(jīng)提取過程直接進樣，以其所得色譜峰面積作為標準。前述3種不同質(zhì)量濃度的血漿樣品測定所得色譜峰面積結(jié)果與標準相比為絕對回收率。結(jié)果見表1。

表1 三種不同質(zhì)量濃度的血漿樣品的絕對回收率

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取空白血漿1.0 mL，按“2.3.3”項下方法制備質(zhì)量濃度為495.00 ng/mL的酮咯酸氨丁三醇血漿質(zhì)控樣品，考察質(zhì)控樣品在室溫放置24 h、-20℃條件下凍融循環(huán)3次、-20℃條件下冷凍15 d，以及血漿質(zhì)控樣品中的酮咯酸氨丁三醇提取溶液在室溫條件下24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。在4種穩(wěn)定性考察條件下，其RSD值分別為3.35%、3.85%、3.67%、3.45%，說明酮咯酸氨丁三醇血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.3.8 藥代動力學(xué)參數(shù)計算 數(shù)據(jù)結(jié)果由中國藥科大學(xué)編制的藥代動力學(xué)軟件BAPP 2.0計算生成，Tmax和Cmax采用實測值，采用半對數(shù)作圖法，由消除相末端的濃度點即直線斜率計算t1/2，計算主要藥代動力學(xué)參數(shù)，使用梯形法計算藥-時曲線下面積AUC值，求出受試制劑相對生物利用度F。

3 結(jié)果

3.1 藥代動力學(xué)數(shù)據(jù) 18例受試者分別口服酮咯酸氨丁三醇分散片和膠囊后平均藥-時曲線見圖1，主要藥動學(xué)參數(shù)見表2。

圖2 受試者分別口服分散片和膠囊后平均血藥濃度-時間曲線

表2 口服分散片和膠囊后受試者血漿中酮咯酸氨丁三醇藥動學(xué)參數(shù)(±s，n=18)

表2 口服分散片和膠囊后受試者血漿中酮咯酸氨丁三醇藥動學(xué)參數(shù)(±s，n=18)

注:兩組比較，P＞0.05

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3.2 生物等效性評價 表2中的Tmax經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗，Cmax和AUC(0→24)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析，采用雙單側(cè)t檢驗和(1-2α)置信區(qū)間法進行生物等效性評價。對酮咯酸氨丁三醇分散片和膠囊的Tmax采用非參數(shù)法進行評價，結(jié)果表明，兩制劑Tmax差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Cmax的90%置信區(qū)間為參比制劑的93.61%～103.13%，在70%～143%范圍內(nèi);受試制劑中酮咯酸氨丁三醇 AUC(0→24)的 90%置信區(qū)間為參比制劑的92.52% ～102.01%，在80% ～125%范圍內(nèi)，表明兩種制劑的Cmax、AUC(0→24)拒絕生物不等效假設(shè)，受試制劑與參比制劑差異無統(tǒng)計學(xué)意義，受試制劑酮咯酸氨丁三醇分散片的相對于參比制劑酮咯酸氨丁三醇膠囊的生物利用度為97.86%±11.62%，兩種制劑的 Cmax、AUC(0→24)拒絕生物不等效假設(shè)，酮咯酸氨丁三醇分散片劑與膠囊劑具有生物等效性。

4 討論

有研究采用RP-HPLC法測定血漿中酮咯酸氨丁三醇濃度，優(yōu)化了血漿樣品處理方法，提高了方法靈敏度，減少了樣品內(nèi)源性干擾，方法重現(xiàn)性好，專一性強，可滿足酮咯酸氨丁三醇藥物動力學(xué)及生物利用度研究要求［4-5］。酮咯酸氨丁三醇被人體吸收后，轉(zhuǎn)化為弱酸鹽酮咯酸，有較好的水溶性。如果采用直接沉淀蛋白進樣測定，雖然方法簡便，但是血漿中的酮咯酸與雜質(zhì)無法有效分離，且在低濃度范圍監(jiān)測靈敏度達不到準確定量要求。若直接采用有機溶劑也無法充分提取樣品中的酮咯酸鹽，可在樣品中加入0.6 mol/L硫酸溶液使其解離度降低，提高提取效率;最后精密加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液從正己烷中反萃出酮咯酸，不但去除樣品中脂溶性雜質(zhì)，還使酮咯酸的濃度進行了富集，較直接沉淀法提高了檢測靈敏度。

流動相選用磷酸二氫鉀緩沖溶液(pH=2.5)-甲醇的原因是由于在該體系下，酮咯酸色譜峰峰形對稱性較甲醇-水體系更佳、理論塔板數(shù)更高。另外，磷酸二氫鉀可作為酮咯酸分子離解抑制劑，通過調(diào)節(jié)流動相的pH值，促使其在流動相中以酮咯酸分子的形式存在，抑制離解，增強其在色譜柱上的保留，同時減少峰的拖尾，并顯著提高分離效果。

酮咯酸氨丁三醇分散片劑口服后較膠囊劑吸收更快，血藥濃度在約0.68 h即達峰濃度，而膠囊劑則要在0.8 h左右達峰，故分散片劑較膠囊劑鎮(zhèn)痛起效更快;考慮藥物制劑體外溶出的各種影響因素，說明體內(nèi)吸收差異主要是兩種劑型的生產(chǎn)工藝差異造成的。

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