郭蓮怡，王桂君，史 璇

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 消化科，遼寧錦州 121001

肝腎綜合征(hepatorenal syndrome，HRS)是由于嚴(yán)重的肝功能損害及門(mén)脈高壓所致的急性功能性腎衰竭，是終末期肝病常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，腎血管收縮是HRS的主要原因。有研究表明肝硬化時(shí)腎臟對(duì)縮血管物質(zhì)的敏感性增強(qiáng)[1]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)作為重癥肝炎發(fā)生的重要因子[2]，與重癥感染時(shí)腎衰的發(fā)生發(fā)展明顯相關(guān)[3]。然而，TNF-α在HRS腎血管收縮中的作用及機(jī)制目前還不清楚。本研究應(yīng)用離體灌注腎技術(shù)觀察TNF-α預(yù)灌流離體大鼠腎臟后，腎血管對(duì)內(nèi)皮素(endothelin，ET)收縮反應(yīng)性的改變。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇清潔級(jí)雄性SD大鼠28只，體質(zhì)量250~300 g。(由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2003-0007，開(kāi)放系統(tǒng)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h)。

2 主要試劑和儀器 TNF-α(Sigma公司)、ET-1(Sigma公司)、2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-APB，Sigma公司)、無(wú)鈣Kreb's灌流液。Minipuls2灌注泵，法國(guó)Gilson；RM6000多導(dǎo)生理記錄儀，日本；恒溫灌注池，廣東；Oxnard CA張力換能器，美國(guó)Gould；氧合器，熱交換器、HTG恒溫器，上海；倒置顯微鏡，德國(guó)Carl Zeiss公司。

3 離體灌注腎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕4]應(yīng)用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)經(jīng)腹腔注射將大鼠麻醉。剪毛，腹壁消毒，正中切開(kāi)，用棉簽分離腸系膜上動(dòng)脈、右腎動(dòng)脈、右腎靜脈及右側(cè)輸尿管。用套管針從腸系膜上動(dòng)脈插管，經(jīng)腹主動(dòng)脈，插入右腎動(dòng)脈起始部，管外接三通，三通接張力換能器和灌注裝置，腎靜脈開(kāi)放。在腸系膜上動(dòng)脈及右腎動(dòng)脈主干分別結(jié)扎。整個(gè)手術(shù)過(guò)程均在10 min左右完成。左腎取出稱重作為對(duì)照腎重。灌注過(guò)程：在腹主動(dòng)脈插管至腎動(dòng)脈時(shí)啟動(dòng)灌注泵，開(kāi)始灌流。灌注液流量恒定為5 ml/min，經(jīng)熱交換器加溫至37℃，經(jīng)氧合器持續(xù)給95%氧和5%二氧化碳的混合氣，灌流液為一次性，不再循環(huán)應(yīng)用。

4 實(shí)驗(yàn)分組 28只大鼠制備離體灌注腎模型后隨機(jī)分為4組(n=7)，平衡期后(開(kāi)始灌流5~10 min后，繼續(xù)穩(wěn)定20 min，共30 min)，進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。具體分組：A1組(n=7)：平衡期后，無(wú)鈣Kreb's液灌流90 min，加ET(1 nmol/L)刺激；A2組(n=7)：平衡期后，用含TNF-α(100 μg/L)的無(wú)鈣Kreb's液灌流90 min，加ET(1 nmol/L)刺激；B1組(n=7)：平衡期后，用無(wú)鈣Kreb's液灌流90 min(其中后10 min加入30 μmol/L的2-APB)，加ET(1 nmol/L)刺激；B2組(n=7)：平衡期后，用含TNF-α(100 μg/L)的無(wú)鈣Kreb's液灌流90 min(其中后10 min加入30 μmol/L的2-APB)，加ET(1 nmol/L)刺激。

5 離體腎體外灌注過(guò)程 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程由多導(dǎo)生理記錄儀連續(xù)記錄腎臟灌注壓。實(shí)驗(yàn)過(guò)程分三個(gè)階段：第一階段(平衡期)：4組在灌流通路上，均先用無(wú)鈣Kreb's液灌流30 min，以達(dá)到平衡；第二階段(灌流期)：各組分別用含特定成分的無(wú)鈣Kreb's液灌流90 min；第三階段(刺激期)：各組均予含ET(1 nmol/L)的無(wú)鈣Kreb's液繼續(xù)灌流20 min。據(jù)報(bào)道離體腎體外灌流140 min內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定[4]，故整個(gè)灌流過(guò)程持續(xù)時(shí)間為140 min。

6 腎臟水腫率及病理檢查 灌流結(jié)束后，各組腎標(biāo)本稱重，計(jì)算腎臟水腫率，腎臟水腫率=(灌流后腎重-對(duì)照腎重)/對(duì)照腎重。4%的多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋、HE染色觀察腎小球及腎小管形態(tài)、結(jié)構(gòu)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料(即各組灌注壓值)以-x±s表示，各組數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 對(duì)基礎(chǔ)灌注壓的影響 平衡期過(guò)后，各組基礎(chǔ)灌注壓比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。TNF-α、2-APB預(yù)灌流時(shí)，基礎(chǔ)灌注壓無(wú)明顯改變。

2 TNF-α對(duì)ET縮血管作用的影響 A1、A2組在應(yīng)用ET(1 nmol/L)刺激后，腎灌注壓較基礎(chǔ)壓均明顯升高(P＜0.05)；A2組灌注壓升高值顯著高于A1組(P＜0.01)。見(jiàn)圖1，表1。

圖 1 TNF-α對(duì)ET縮血管作用的影響Fig. 1 Effect of TNF-α on renal vasoconstriction by ET

3 阻斷IP3R對(duì)TNF-α作用的影響 B1、B2組于灌流后期加入2-APB，刺激期用ET(1 nmol/L)刺激，腎灌注壓均略升高，但與基礎(chǔ)灌注壓比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；兩組灌注壓升高值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖2，表1。

表1 各組大鼠離體腎灌注壓水平Tab. 1 Renal perfusion pressure of each group(mmHg, -x±s, n=7)

4 腎臟水腫率及病理變化 4組腎臟的水腫率分別為28%±2%、29%±3%、28%±3%、27%±2%，且灌流后的腎臟標(biāo)本切片經(jīng)HE染色均未發(fā)現(xiàn)明顯的器質(zhì)性損傷，與灌流前相符。見(jiàn)圖3。

討 論

重型肝炎和各種原因引起的肝硬化常并發(fā)多臟器功能衰竭，尤其當(dāng)并發(fā)HRS時(shí)，患者的預(yù)后極差，80%~100%的患者在診斷后的1個(gè)月內(nèi)死亡。HRS不同于原發(fā)性腎臟疾病的腎衰竭，它缺乏后者所具有的臨床、實(shí)驗(yàn)室和組織學(xué)的改變，目前認(rèn)為HRS的發(fā)生是由于腎血管收縮造成腎臟明顯低灌流的結(jié)果，其機(jī)制尚不完全清楚。當(dāng)HRS發(fā)生時(shí)，患者血清中許多縮血管活性物質(zhì)水平明顯增高，并可直接或通過(guò)間接途徑引起腎血管收縮，是導(dǎo)致腎血流灌注和腎功能紊亂的重要介質(zhì)[1]。近年來(lái)學(xué)者們認(rèn)為：重型肝炎患者血中高濃度的TNF-α是引起多臟器功能衰竭發(fā)生的重要因子[2]，許多研究表明TNF-α可通過(guò)多種途徑引起血管收縮，從而參與相關(guān)疾病的病理生理過(guò)程：1)TNF-α可通過(guò)TNFR2和ET-ETR依賴途徑引起血管收縮。TNF-α可通過(guò)引起ET產(chǎn)生增多來(lái)發(fā)揮縮血管作用。當(dāng)阻斷ETA、、ETB受體后，TNF-α就不再有縮血管作用了[5]。2)TNF-α抑制內(nèi)皮依賴的一氧化氮-環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(NO-CGMP)途徑導(dǎo)致血管收縮。首先TNF-α通過(guò)活化蛋白激酶C(PKC)抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化從而抑制eNOS的活性；同時(shí)TNF-α可通過(guò)縮短eNOS mRNA的半衰期來(lái)下調(diào)eNOS mRNA[6]。3)TNF-α可增強(qiáng)Ca2+依賴及非Ca2+依賴蛋白激酶活性，增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞收縮[7]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：腎臟經(jīng)含TNF-α的無(wú)鈣Kreb's液灌流后，其腎血管對(duì)ET的反應(yīng)提高，表現(xiàn)為腎血管灌注壓明顯高于非TNF-α處理組。結(jié)果顯示：TNF-α可增強(qiáng)ET引起的腎血管收縮。

腎血流量受血管平滑肌的收縮和舒張調(diào)節(jié)，而血管平滑肌的收縮和舒張又受平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加受兩個(gè)作用機(jī)制來(lái)調(diào)控[8]：一方面胞外Ca2+進(jìn)入胞內(nèi)：各種刺激，如膜電壓改變、受體結(jié)合、第二信使及機(jī)械刺激都可以使細(xì)胞膜上的Ca2+通道開(kāi)放，引起胞外Ca2+大量?jī)?nèi)流；另一方面胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放Ca2+：各種刺激使肌漿網(wǎng)(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))膜上的鈣釋放通道開(kāi)放，引起細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)備Ca2+的釋放。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用無(wú)鈣Kreb's液灌流腎臟，不存在胞外Ca2+內(nèi)流這一因素，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明：TNF-α可通過(guò)促進(jìn)胞內(nèi)鈣釋放進(jìn)而增強(qiáng)ET的腎血管收縮作用。

已知ET等血管活性物質(zhì)與靶細(xì)胞膜上特異性受體(如ET受體)結(jié)合后，使膜磷脂酰肌醇4，5-二磷酸發(fā)生磷酸化生成IP3，IP3與IP3R(胞內(nèi)主要的Ca2+釋放通道)結(jié)合則促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，使胞內(nèi)Ca2+水平增高[9]，引起細(xì)胞收縮。2-APB是一種常用的IP3R的阻斷劑，可特異性阻斷IP3R[10]，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用含2-APB及TNF-α的無(wú)鈣Kreb's液灌流腎臟，其腎血管對(duì)ET的反應(yīng)較差，ET刺激后的腎血管灌注壓無(wú)顯著變化。結(jié)果表明：2-APB可阻斷TNF-α的前述作用，說(shuō)明TNF-α可能通過(guò)上調(diào)IP3R進(jìn)而增強(qiáng)ET引起的腎血管收縮。

已有研究報(bào)道：TNF-α可誘導(dǎo)腎小球纖維蛋白沉積、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞凋亡，引起GFR下降。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有的腎臟標(biāo)本稱重，計(jì)算其水腫率＜30%，說(shuō)明灌流成功；并進(jìn)行常規(guī)病理檢查均未發(fā)現(xiàn)腎小管及腎小球細(xì)胞病理性改變，故排除了實(shí)驗(yàn)結(jié)果受器質(zhì)性腎臟損傷影響的因素[11]。

綜上所述，重癥肝炎患者血中存在的高濃度TNF-α可能上調(diào)IP3R，促進(jìn)胞內(nèi)鈣釋放，誘導(dǎo)腎入球動(dòng)脈平滑肌收縮性增強(qiáng)，腎入球動(dòng)脈收縮，造成腎血流減少，參與HRS發(fā)生。

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