顏繼忠，廖 倩，李行諾

（浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032）

超濾法純化茯苓多糖的工藝優(yōu)化

顏繼忠，廖 倩，李行諾

（浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032）

研究超濾法分離純化茯苓多糖的工藝條件.以截留分子量為10 k Da的超濾膜對(duì)茯苓多糖進(jìn)行超濾分離，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究壓力、溫度和初始料液比三個(gè)因素對(duì)茯苓多糖超濾的影響，并以膜通量和截留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化最佳超濾條件.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：茯苓多糖的最佳超濾條件為壓力0.225 MPa、溫度25℃、初始料液比2 g／L.在此條件下茯苓多糖的截留率為77.32%，多糖制品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由42.86%提高到88.40%.說(shuō)明超濾法是純化茯苓多糖的有效方法之一.

茯苓；多糖；超濾；截留率

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，是一味使用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥，被列入中藥八珍之一，主產(chǎn)于云南、福建、安徽等地［2］.茯苓的主要成分為多糖和三萜，其中多糖含量占茯苓干重的84%以上［3］.現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖在抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老及防治神經(jīng)退行性疾病等方面具有顯著作用［4－7］.此外還有降血糖、抗炎、抗白血病等作用［8－10］.由于多糖的生理活性與其結(jié)構(gòu)、分子量及溶解度等因素密切相關(guān)，因此如何有效地分離純化多糖是多糖研究的首要任務(wù)之一.超濾是一種新型膜分離技術(shù)，利用不同的孔徑截留不同分子量的物質(zhì)，因其具有操作簡(jiǎn)單、條件溫和、分離效率高、可防止熱敏物質(zhì)失活等優(yōu)點(diǎn)，已成為多糖分離純化研究的重要手段.

筆者首次采用微濾結(jié)合超濾法分離純化茯苓多糖，據(jù)文獻(xiàn)［11］報(bào)道茯苓多糖的分子量分布范圍是26～268 k Da，因此本試驗(yàn)先采用0.2μm的聚砜膜微濾除去茯苓多糖溶液中的大分子雜質(zhì)，再將透析液通過(guò)10 k Da超濾裝置對(duì)茯苓多糖進(jìn)一步純化研究，并優(yōu)化超濾試驗(yàn)操作條件，測(cè)定所得產(chǎn)品中茯苓多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為茯苓多糖及超濾技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域和保健品行業(yè)中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓多糖提取物由浙江惠松制藥有限公司提供.無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚和葡萄糖等均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

UV754紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；Flow Mem-001螺旋膜小試設(shè)備、截留分子量為0.2μm和10 k Da的聚砜膜（廈門世達(dá)膜有限公司）；JA2003N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；RE2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；真空冷凍干燥儀（2.5 L，美國(guó)LABCONCO公司）；Milli-Q純水儀（美國(guó)Millipore公司）.

1.3 方 法

1.3.1 工藝流程

茯苓多糖提取物→加入四倍體積無(wú)水乙醇，4℃沉淀24 h→收集沉淀→洗滌→真空冷凍干燥→多糖粗品→加去離子水溶解→布氏漏斗過(guò)濾→微濾→超濾→濃縮→真空冷凍干燥→多糖制品.

1.3.2 超濾方法

采用螺旋膜小試設(shè)備純化茯苓多糖，準(zhǔn)確稱取茯苓多糖按一定料液比溶解，將盛放料液的大燒杯放入恒溫水浴鍋控溫，透過(guò)液采用量筒收集，膜通量與截留率計(jì)算公式如下［12］：

式中：J為膜通量，L／m2·h；V為超濾時(shí)間內(nèi)透過(guò)液的體積，L；S為有效膜面積，m2；T為超濾時(shí)間，h.

式中：R為多糖截留率，%；V2，ρ2分別為超濾后截留液的體積和多糖濃度；V1，ρ1分別為超濾前提取液的體積和多糖濃度.

1.3.3 茯苓多糖超濾的單因素試驗(yàn)

1）壓力對(duì)茯苓多糖超濾的影響

茯苓多糖的初始料液比為2 g／L，通過(guò)0.2μm膜微濾后，將透過(guò)液定容至1 000 mL，在選用10 KDa的膜，控制溫度為25℃，壓力分別為0.20，0.25，0.30 MPa，以膜通量和截留率為評(píng)價(jià)指標(biāo).考察不同壓力對(duì)茯苓多糖超濾的影響.

2）溫度對(duì)茯苓多糖超濾的影響

茯苓多糖的初始料液比為2 g／L，通過(guò)0.2μm膜微濾后，將透過(guò)液定容至1 000 mL，再選用10 k Da的膜，控制壓力為0.25 MPa，溫度分別為25，35，45℃，以膜通量和截留率為評(píng)價(jià)指標(biāo).考察不同溫度對(duì)茯苓多糖超濾的影響.

3）初始料液比對(duì)茯苓多糖超濾的影響

茯苓多糖提取物的初始料液比分別為1，2，3 g／L，通過(guò)0.2μm膜微濾后，將透過(guò)液定容至1 000 mL，再選用10 k Da的膜，控制超濾壓力為0.25 MPa，溫度為25℃，以膜通量和截留率為評(píng)價(jià)指標(biāo).考察不同初始料液比對(duì)茯苓多糖超濾的影響.

1.3.4 茯苓多糖超濾的工藝優(yōu)化

以壓力、溫度、初始料液比三個(gè)因素設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，以膜通量和截留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定茯苓多糖的最佳超濾工藝.試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平表見(jiàn)表1.

表1 茯苓多糖超濾工藝的正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in L9（33）orthogonal array design for optimal polysaccharide ultrafiltration process

1.4 分析評(píng)價(jià)

1.4.1 茯苓多糖的測(cè)定方法

總糖測(cè)定采用苯酚－硫酸法［13］.

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓多糖超濾的單因素試驗(yàn)

2.1.1 壓力對(duì)茯苓多糖超濾的影響

圖1 壓力對(duì)截留率和膜通量的影響Fig.1 Effect of pressure on the retention of polysaccharides and the membrane flux

由圖1可知：隨著壓力的增大，膜通量顯著增大.但當(dāng)壓力大于0.25 MPa時(shí)，由于膜表面的濃差極化作用加劇，開(kāi)始形成膜面凝膠層，導(dǎo)致阻力大大增加，因而膜通量的增加減少［14］.當(dāng)壓力在0.25 MPa時(shí)，截留率較好.綜合考慮，壓力范圍選擇在0.20～0.25 MPa之間.

2.1.2 溫度對(duì)茯苓多糖超濾的影響

由圖2可知：隨著溫度的升高，截留率降低而膜通量增大.這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，升高溫度使溶液粘度下降、擴(kuò)散系數(shù)和傳質(zhì)系數(shù)增大、多糖溶解度增大，濃差極化相應(yīng)減小，所以導(dǎo)致膜通量逐漸增大而截留率降低［15］.此外也有報(bào)道指出當(dāng)溫度高于50℃時(shí)會(huì)導(dǎo)致多糖的活性降低以及濾膜的性能發(fā)生改變［16］.因此綜合考慮，操作溫度控制在35℃以下為宜.

圖2 溫度對(duì)截留率的影響Fig.2 Effect of temperature on the retention of polysaccharides and the membrane flux

2.1.3 初始料液比對(duì)茯苓多糖超濾的影響

由圖3可知：隨著初始料液比的增加，茯苓多糖的膜通量逐漸減小.這是因?yàn)殡S著初始料液濃度的增大，料液的粘度增大，溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)減小，濃差極化加重，造成膜通量下降.當(dāng)料液比為2 g／L時(shí)，截留率最佳.理論上多糖應(yīng)盡量稀釋減少膜的污染以及多糖的損失，但考慮到膜分離后多糖溶液需濃縮凍干，如果溶液體積過(guò)大，不僅消耗能量而且浪費(fèi)時(shí)間，因此，初始料液比選擇在2 g／L左右較為適宜.

圖3 初始料液比對(duì)截留率的影響Fig.3 Effect of material／liquid ratio on the retention of polysaccharides and the membrane flux

2.2 茯苓多糖超濾的工藝優(yōu)化

壓力、溫度、初始料液比的L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理見(jiàn)表2.

由表2的直觀分析可知：影響茯苓多糖平均膜通量主次關(guān)系是A＞B＞C，即操作壓力的影響最大，其次是溫度，初始料液比的影響最小.影響茯苓多糖截留率的主次關(guān)系是B＞A＞C，即溫度的影響最大，其次是壓力，初始料液比的影響最小.因此從k值上綜合考慮確定最優(yōu)工藝組合條件為A2B1C2，即操作壓力0.225 MPa、溫度25℃、初始料液比2 g／L.

表2 L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果1）Table 2 result of L9（33）orthogonal array design tests for optimal polysaccharides ultra filtration process

3 結(jié) 論

采用10 k Da聚砜膜超濾茯苓多糖的最佳工藝條件為操作壓力0.225 MPa、溫度25℃、初始料液比2 g／L.在此條件下茯苓多糖的截留率為77.32%，平均膜通量為34.70 L／（m2·h），多糖制品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由42.86%提高到88.40%.

超濾法能有效除去茯苓多糖中的大分子蛋白、多酚、色素等物質(zhì)，且與傳統(tǒng)的除蛋白和脫色方法相比，操作簡(jiǎn)單、條件溫和，不僅可以有效避免多糖在操作過(guò)程中活性降低，還大大提高了多糖的純度，也提高了多糖進(jìn)一步分離純化的效率.不過(guò)聚砜膜的壽命較短，在多次重復(fù)超濾過(guò)后，膜通量會(huì)逐漸降低，清洗后也很難恢復(fù)到原來(lái)的膜通量，需及時(shí)更換新膜.因此隨著膜材料的日益改進(jìn)，超濾法將是多糖純化工藝發(fā)展的新趨勢(shì).

［1］胡斌，楊益平，葉陽(yáng).茯苓化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2006，37（5）：655-658.

［2］林標(biāo)聲.茯苓多糖的發(fā)酵、提取及其理化、結(jié)構(gòu)性質(zhì)鑒定的研究［D］.開(kāi)封：河南大學(xué)，2008.

［3］付玲，于淼.茯苓研究的新進(jìn)展［J］.新疆中醫(yī)藥，2005，23（3）：79-83.

［4］HUANG Qi-lin，JIN Yong，ZHANG Li-na，et al.Structure，molecular size and antitumor activeities of polysaccharides from Poria cocos mycelia produced in fermenter［J］.Carbohydrate Polymers，2007，70：324-333.

［5］ZHANG M，CHIU L C，CHEUNG P C，et al.Growth-inhibitory effects of a heta-glucan from the mycelium of Poria cocos on human breast carcinoma MCF-7 cells：cell-cycle arrest and apoptosis induction［J］.Oncol Rep，2006，15（3）：637-43.

［6］侯安繼，陳騰云，彭施萍，等.茯苓多糖抗衰老作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2004，20（3）：10-11.

［7］安文林，張?zhí)m，李雅莉，等.茯苓水提液對(duì)疊氮鈉致原代培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷的影響［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2001，36（7）：450-454.

［8］LI T H，HOU C C，CHANG C L，et al.Anti-Hyperglycemic properties of crude extract and Triterpenes from Poria cocos［EB／OL］.［2011-12-08］.http：／／www.hindawi.com／journals／ecam／2011／128402／.

［9］LEE K Y，JEON Y J，Polysaccharide isolated from Poria cocos sclerotium induces NF-κB／Rel activation and iNOS expression in murine macrophages［J］.International Immunopharmacology，2003，3：1353-1362.

［10］CHEN Y Y，CHANG H M.Antiproliferative and differentiating effects of polysaccharide fraction from fu-ling（Poria cocos）on human leukemic U937 and HL-60cells［J］.Food and Chemical Toxicology，2004，42：759-769.

［11］CHEN Xiao-yu，XU Xiao-juan，ZHANG Li-na，et al.Chain conformation and anti-tumor activities of phosphorylated（1→3）-β-D-glucan from Poria cocos［J］.Carbohydrate Polymers，2009，78：581-587.

［12］王子堯，陳彥，孫文秀.超濾法分離丹皮多糖的研究［J］.膜科學(xué)與技術(shù)，2009，29（5）：98-100.

［13］張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.第2版.杭州：浙江大學(xué)出版社，1994：36-37.

［14］顧覺(jué)奮.分離純化工藝原理［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2002：166.

［15］韓永萍，劉揚(yáng)平.膜法分級(jí)純化姬松茸子實(shí)體多糖的研究［J］.中草藥，2006，37（3）：365-368.

［16］焦光聯(lián)，楊艷，何葆華，等.超濾提取黃芪多糖的工藝研究［J］.化學(xué)與生物工程，2010，27（8）：58-61.

Purification of polysaccharide from Poria cocos by ultrafiltration membrane technology

YAN Ji-zhong，LIAO Qian，LI Xing-nuo
（College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

Ultrafiltration of polysaccharide from Poria cocos was investigated by examining the effects of pressure，temperature and material／liquid ratio on the membrane flux and retention using single factor method coupled with orthogonal array design.Results showed that the optimal values of the above parameters were determined as follows：pressure 0.225 MPa，temperature 35℃，material／liquid 2 g／L.In the optimal conditions，the retention of polysaccharides was 96.56%，the content was increased from 42.66%to 88.4%.The result showed that it was suitable to separate the polysaccharides from Poria cocos by ultrafiltration.

Poria cocos；polysaccharide；ultrafiltration；retention

R283.5

A

1006-4303（2013）02-0122-04

2012-03-07

浙江省科技廳中藥現(xiàn)代化重大專項(xiàng)“藥用真菌多糖類活性物質(zhì)高效分離與篩選關(guān)鍵技術(shù)”（2009C13029）

顏繼忠（1964—），男，福建永春人，教授，碩士，研究方向?yàn)橹兴幩幮С煞痔崛》蛛x與質(zhì)量控制，E-mail：yjz＠zjut.edu.cn.

（

陳石平）