尹翠翠 藺建軍，2 楊 勇△ 容 蓉 王曉莉

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東醫(yī)藥技師學(xué)院，山東 泰安 271000）

3種制法的四逆湯抗大鼠急性缺血性心肌梗死的藥效比較*

尹翠翠1藺建軍1，2楊 勇1△容 蓉1王曉莉1

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東醫(yī)藥技師學(xué)院，山東 泰安 271000）

目的 比較3種制法的四逆湯抗大鼠急性缺血性心肌梗死模型的藥效，確定較佳的制劑方案。方法將Wistar大鼠隨機(jī)心肌缺血組、假手術(shù)組、傳統(tǒng)四逆湯組、藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組。各給藥組均預(yù)先給大鼠灌胃4 d（2 g/mL），第4日給藥30 min后進(jìn)行急性缺血性心肌梗死手術(shù)，6 h后處死動(dòng)物取血，檢測(cè)各組血漿CK活性、MDA和SOD含量；用TTC染色測(cè)定各組心臟梗死面積。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，心肌缺血組血漿CK、MDA含量明顯升高；與心肌缺血組比較，傳統(tǒng)四逆湯組、藥典四逆湯組均能明顯降低CK含量；與假手術(shù)組比較，心肌缺血組SOD有降低趨勢(shì)，藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組有升高SOD趨勢(shì)；與心肌缺血組比較，藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組有降低MDA含量的趨勢(shì)。與假手術(shù)組比較，心肌缺血組大鼠心臟梗死率明顯增大；與心肌缺血組比較，藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組心臟梗死率均顯著縮小。結(jié)論 綜合分析后認(rèn)為藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯是治療大鼠急性缺血性心肌梗死的較佳方案。

四逆湯 急性心肌梗死 制備方法 藥效學(xué)比較

△通信作者

Comparison Study of Pharmacodynamics that Three Different Extraction Methods of Sini Decoction on

四逆湯由附子、干姜、炙甘草組成，具有回陽(yáng)救逆之功效，現(xiàn)代研究主要以此3味藥的主要有效成分含量為質(zhì)控依據(jù)，篩選和優(yōu)化四逆湯的最佳提取方案［1-3］。但由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜，藥物間的配伍關(guān)系及相互作用極為關(guān)鍵，因此不能僅從有效成分含量上反映四逆湯的藥效作用強(qiáng)弱。為了更加真實(shí)準(zhǔn)確地反映四逆湯對(duì)心肌的防治作用，本課題以急性缺血性心肌梗死大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)比較3種制法的四逆湯抗大鼠急性缺血性心肌梗死模型的藥效，確定治療大鼠急性缺血性心肌梗死的較佳方案。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，50只，體質(zhì)量250～300 g，由山東魯抗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物可證編號(hào)：SCXK（魯）20080002。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～26℃，相對(duì)濕度40%～70%RH。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；紫外分光光度計(jì)，型號(hào)：UV2201，日本島津；半自動(dòng)生化分析儀，型號(hào)：威圖Micr300，荷蘭威圖科學(xué)公司；JA5003型電子天平，上海精科天平廠；GL-20A型全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)，湖南離心機(jī)廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑肌酸激酶（CK），批號(hào)：110761；21項(xiàng)生化質(zhì)控品，批號(hào)：111711，購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司；丙二醛（MDA）試劑盒，批號(hào)：20111216；總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒，批號(hào)：20110827，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC），批號(hào)：20110720，購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥材附子，產(chǎn)地四川江油，為毛莨科多年生草本植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx的子根的加工品。甘草，產(chǎn)地河北，為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根莖。干姜，產(chǎn)地廣西來(lái)賓，為姜科多年生草本姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖。以上藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定合格。

2 方 法

2.1 四逆湯溶液的制備

2.1.1 傳統(tǒng)四逆湯的制備 按照傳統(tǒng)臨床常用處方（黑附子450 g，干姜300 g，炙甘草450 g）用量及用法，蒸餾水浸泡1 h，加水量分別是8倍和6倍，水煎煮2次，第1次30 min，第2次20 min，合并濃縮至藥液濃度為2 g/mL（每1 mL藥液相當(dāng)于2 g生藥材）。制備得四逆湯提取液，冷藏備用。

2.1.2 藥典四逆湯的制備［4］取藥材粗粉（過(guò)20目篩）黑附子450 g，炙甘草450 g，加8倍量水加熱回流提取2 h，過(guò)濾，殘?jiān)?倍量水加熱回流提取1 h，過(guò)濾，濾液合并。取藥材粗粉（過(guò)20目篩）干姜300 g，加12倍量水，水蒸氣蒸餾提取5 h，揮發(fā)油和蒸餾后的水溶液備用，殘?jiān)?倍量水煎煮1 h，過(guò)濾，煎液與上述水溶液合并，濾過(guò)，再與附子、炙甘草提取液合并，濃縮至600 mL，加無(wú)水乙醇1800 mL，靜置24 h后，濾過(guò)，減壓濃縮至適量，用適量水稀釋，冷藏24 h，濾過(guò)，加入上述揮發(fā)油，加水至600 mL，冷藏備用。

2.1.3 單藥混合四逆湯的制備［5］（1）黑附子中生物堿的提?。核幉拇址郏ㄟ^(guò)20目篩）450 g，精密稱定，24倍量pH=1.0酸水提取2次，振蕩浸提，每次1.5 h，過(guò)濾，合并濾液并濃縮至約225 mL。（2）炙甘草中黃酮類的提取：藥材粗粉（過(guò)20目篩）450 g，精密稱定，加20倍量0.3%氨水-60%乙醇加熱回流提取4次，每次2 h，過(guò)濾，合并濾液并濃縮至約225 mL。（3）干姜中揮發(fā)油的提?。核幉拇址郏ㄟ^(guò)20目篩）300 g，精密稱定，加14倍量水，浸泡3 h后水蒸氣蒸餾提取5 h，揮發(fā)油和蒸餾后水溶液備用，殘?jiān)?倍量水煎煮1 h，煎液與上次蒸餾后水溶液合并，濃縮至約150 mL。將各單味藥提取液轉(zhuǎn)移合并為600 mL，冷藏備用。

2.2 分組及造模將大鼠分為心肌缺血組、假手術(shù)組、傳統(tǒng)四逆湯組、藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組，每組10只。用4%水合氯醛腹腔麻醉后，氣管插管，行人工呼吸。左側(cè)第3、4肋間開(kāi)胸，剪開(kāi)心包，暴露心肌，并用圓形無(wú)創(chuàng)縫合針6/0絲線置于左冠狀動(dòng)脈前降支起始部下2 mm處結(jié)扎左冠狀前降支動(dòng)脈，以ECGⅡ?qū)?lián)ST段明顯抬高或T波高聳、心肌顏色變暗紅色為結(jié)扎成功的標(biāo)志。假手術(shù)組為穿線不結(jié)扎。傳統(tǒng)四逆湯組、藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組均預(yù)先大鼠灌胃4 d，給藥濃度為21.6 g/kg（即21.6 g生藥材/kg體質(zhì)量），第4日給藥30 min后，進(jìn)行急性缺血性心肌梗死手術(shù)，結(jié)扎大鼠左冠狀前降支動(dòng)脈（方法同上）。

2.3 標(biāo)本采集與檢測(cè)各組大鼠造模成功后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，6 h后分別腹主動(dòng)脈采血，肝素抗凝，置冷凍離心機(jī)中，3000 r/min離心10 min，取上清，-20℃保存待用。各造模大鼠取完血后處死，迅速取出心臟，用冰生理鹽水洗盡殘血，用濾紙吸干稱重，置于-20℃冷凍15 min，15 min后將心臟橫切成1～2 mm厚薄均勻的薄片，置于pH 7.4的1%TTC磷酸鹽緩沖液中，于37℃染色15 min，4%甲醛溶液固定10 min后，分離梗死心肌和正常心?。üＫ佬募〕拾咨?，非梗死心肌呈暗紅色），分別稱重，計(jì)算梗死心肌占全心濕重的百分比（%），即心肌梗死面積。采用半自動(dòng)生化分析儀測(cè)定造模各組血漿CK活性，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)血漿中SOD、MDA含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差（LSD檢驗(yàn)）進(jìn)行組間差異分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 四逆湯3種不同制法對(duì)大鼠血漿中CK、SOD、MDA的影響見(jiàn)表1。與假手術(shù)組比較，心肌缺血組血漿 CK、MDA 含量明顯升高（P＜0.05或 0.01）；與心肌缺血組比較，傳統(tǒng)四逆湯組、藥典四逆湯組均能明顯降低CK含量（P＜0.01）；與假手術(shù)組比較，心肌缺血組SOD有降低趨勢(shì)，藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組有升高SOD趨勢(shì)；與心肌缺血組比較，藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組有降低MDA含量的趨勢(shì)。

表1 各組大鼠血漿中CK、SOD、MDA水平比較（±s）

表1 各組大鼠血漿中CK、SOD、MDA水平比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與心肌缺血組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n MDA（nmol/mL）假手術(shù)組 10 1.61±0.77心肌缺血組 10 2.89±0.71*傳統(tǒng)四逆湯組 10 2.34±1.11 CK（U/L） SOD（U/mL）399.77±146.74 174.10±46.54 625.57±140.26**138.42±67.38 399.32±121.72△△ 142.39±29.83藥典四逆湯組 10 2.19±0.88 338.25±86.04△△ 155.98±36.26單藥混合四逆湯組 10 543.18±50.24 162.28±45.43 1.90±0.64

3.2 四逆湯3種不同制法對(duì)大鼠心肌梗死率的影響見(jiàn)表2。梗死率=梗死區(qū)面積質(zhì)量/全心質(zhì)量×100%。與假手術(shù)組比較，心肌缺血組大鼠心臟梗死面積明顯增大（P＜0.01），與心肌缺血組比較，藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組心臟梗死面積均顯著縮?。≒＜0.01）。

表2 各組大鼠心肌梗死率比較（±s）

表2 各組大鼠心肌梗死率比較（±s）

組 別 n假手術(shù)組 10心肌缺血組 10傳統(tǒng)四逆湯組 10心肌梗死率（%）4.38±6.52 19.81±10.10**12.94±11.54藥典四逆湯組 10 4.92±3.01△△單藥混合四逆湯組 10 5.18±5.19△△

4 討 論

CK是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運(yùn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，是心肌梗死的重要血生化指標(biāo)。在各類進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良以及多發(fā)性肌炎、皮肌炎中CK明顯升高，并具有診斷價(jià)值。在臨床上，CK及其同工酶活性的檢測(cè)主要用于診斷與監(jiān)控心肌損傷等疾病。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與心肌缺血組組比較，3種制法的四逆湯均可降低心肌缺血大鼠血漿中CK含量，其中傳統(tǒng)四逆湯組和藥典四逆湯組具有顯著差異，單藥混合四逆湯組雖有降低趨勢(shì)，但是并無(wú)明差異，提示傳統(tǒng)四逆湯組和藥典四逆湯組在降低CK活性上效果均優(yōu)于單藥混合四逆湯組。SOD具有特殊的生理活性，在生物體內(nèi)具有清除自由基的首要作用，研究表明SOD對(duì)氧化物和過(guò)氧化物的毒性防御具有重要作用，通過(guò)消除自由基達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。MDA是機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)能產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物，通過(guò)測(cè)定MDA的含量揭示了自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化在腦缺血、心缺血、缺氧神經(jīng)細(xì)胞損害中的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與心肌缺血組比較，3種制法的四逆湯均可提高SOD含量，同時(shí)降低MDA含量，其中單藥混合四逆湯組作用效果最為明顯。因大鼠體質(zhì)量及心臟大小有差異，故用梗死率比較梗死程度。在各實(shí)驗(yàn)組心肌梗死率比較中，與心肌缺血組比較，3種不同制法的四逆湯均可縮小大鼠急性缺血性心肌梗死率，其中藥典四逆湯組和單藥混合四逆湯組差異顯著，其結(jié)果與假手術(shù)組差異較小，提示藥典四逆湯和單藥混合四逆湯組的制備方法均優(yōu)于傳統(tǒng)四逆湯的制備方法。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多指標(biāo)對(duì)3種不同制法的四逆湯抗大鼠急性缺血性心肌梗死的藥理作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)，認(rèn)為四逆湯能夠有效清除氧自由基，減少自由基損壞性因子，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少心肌酶釋放，改善缺血心肌灌流，對(duì)大鼠心臟具有積極保護(hù)作用，其藥效作用的強(qiáng)弱與四逆湯的制備方法密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示傳統(tǒng)四逆湯在降低急性心肌缺血大鼠血漿中CK活性上效果較好，但是對(duì)血漿中SOD、MDA及心肌梗死率影響較小，因此不認(rèn)為此治療方法是抗大鼠急性缺血性心肌梗死的較佳方案。藥典四逆湯降低急性心肌缺血大鼠血漿中CK活性的效力強(qiáng)于單藥混合四逆湯，但是在提高SOD、降低MDA的含量效果上弱于單藥混合四逆湯，兩者在縮小急性心肌缺血大鼠心肌梗死率上效果相近，與急性心肌缺血組比較均具有顯著差異，綜合分析后認(rèn)為藥典四逆湯、單藥混合四逆湯是治療大鼠急性缺血性心肌梗死的較佳方案。

［1］李瑩，章津銘，傅超美，等.不同方法制備四逆湯中化學(xué)成分對(duì)比研究［J］.中草藥，2012，34（4）：673-677.

［2］凌家俊，周莉玲.四逆湯提取工藝的篩選［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17（4）：167-169.

［3］劉曉，范林乾，蔡皓，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選四逆湯機(jī)械煎煮工藝［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（20）：24-27.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：650.

［5］王曉莉，鞏麗麗，容蓉，等.3種方法制備的四逆湯中甘草苷、甘草酸含量測(cè)定［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（6）：71-74.

Anti-acute Ischemic Myocardial Infarction

YIN Cui-cui1，LIN Jian-jun1，2，YANG Yong1，et al. 1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Shandong，Jinan 250355，China；2 Shandong Medicine Technician College，Shandong，Jinan 271000，China

Objective:To compared the pharmacodynamics that Sini Decoction with three methods of extraction o anti-acute ischemic myocardial infarction and to determine a better solution for the treatment of anti-acute ischemic myocardial infarction.Methods:Wistar rats were divided randomly into the myocardial ischemia group，he sham-operation control group，the traditional Sini Decoction（SND） group，the pharmacopoeias SND group and THE single-agent mixed SND group.The myocardial ischemia rat group were established by ligation of the left anterior descending coronary artery under 2 mm from starting.The sham-operation group rats were threaded but not ligation.The traditional SND group，the pharmacopoeias SND group，and the single-agent mixed SND group ats were all given SND for 4 days by intragastric administration.The acute ischemic myocardial infarction operaion was executed after

SND thirty minutes in the fourth day.These animals were sacrificed after 6 hours and the blood was collected.Then detected the CK activity，the contents of MDA and SOD in blood plasma of every group.TTC stained myocardial infarct size was measured.Results:Comparing with the sham-operation group，he contents of CK，MDA in myocardial ischemia group were significantly increased.Compared with the myocardial ischemia group，the traditional SND group，pharmacopoeias SND group could reduce the contents of CK obviously.Comparing with the sham-operation group，the contents of SOD in myocardial ischemia group had the trend o decrease，and pharmacopoeias SND group，and single-agent mixed SND group had the trend to increase.Compared with the myocardial ischemia group，the contents of MDA in pharmacopoeias SND group，and single-agent mixed SND group had the trend to decrease.Comparing with sham-operation group，myocardial infarct size of the myocardial ischemia group was enlarged remarkably.Compared with the myocardial ischemia group，myocardial nfarct sizes of pharmacopoeias SND group and single-agent mixed SND group were significantly reduced.Conclusion:It is showed that SND can remove effectively oxygen free radicals.It can reduce the free radical damage actor，the lipid peroxidation and the release of myocardial enzymes.Meanwhile，It can improve the perfusion of myocardial ischemia and protect positively to myocardial ischemia of the rat.It is considered that pharmacopoeias SND and single-agent mixed SND are the better solutions for the treatment of acute ischemic myocardial infarction by comprehensive analysis.

Sini Decoction；Acute myocardial infarction；Extraction methods；Pharmacodynamics comparison

R285.5

A

1004-745X（2013）06-0880-03

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（J10LF20）

2013-03-04）