劉 盧，呂邵娃，張坤馳，李永吉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040)

龍膽苦苷是龍膽科龍膽屬植物的有效成分，是龍膽及當(dāng)藥等植物中的苦味成分，屬于裂環(huán)烯醚萜苷類，極性大，在有機(jī)溶劑中溶解度較小.龍膽苦苷具有保護(hù)肝臟、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛及抗腫瘤等作用，同時(shí)，龍膽苦苷能減輕二甲苯導(dǎo)致的小鼠耳腫脹，緩解冰醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)，對四氯化碳所致肝損傷整體動(dòng)物有保護(hù)作用[1－3]，龍膽苦苷單體口服吸收快但不完全，半衰期短，生物利用度低[4].聚乳酸－羥基乙酸共聚物(PLGA)是合成的可生物降解的高分子材料[5]，具有良好的生物相容性，作為藥物載體，具有控制藥物釋放，提高藥物療效，降低藥物毒性等特點(diǎn)[6]，被視為理想的聚合物載體材料且廣泛應(yīng)用于各種藥物的納米制劑.為了提高龍膽苦苷生物利用度，本文將龍膽苦苷制成PLGA納米粒，并對其制備工藝和性質(zhì)表征進(jìn)行深入研究.

1 試劑與儀器

1.1 試劑

龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品(Cheng Du Must Bio－Technology Co.Ltd.批號:MUST －11011401);泊洛沙姆188(上海運(yùn)宏化工制劑輔料技術(shù)有限公司);乳酸－乙醇酸共聚物(PLGA，山東省醫(yī)療器械研究所);乙酸乙酯(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司);丙酮(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);甲醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司).

1.2 儀器

美國Waters公司高效液相色譜儀(系統(tǒng):2996Photodiode Array Detector);色譜柱 Diamonsil C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm);DT －100 型電子分析天平(上海醫(yī)用科學(xué)激光儀器廠);85－2A恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(天津玻璃儀器廠);TGL－16C高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);Malvern Zetasizer 3000粒度測定儀 (英國Malvern公司);透射電子顯微鏡(TEM，TECNAIG2，荷蘭飛利浦).

2 方法與結(jié)果

2.1 龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm);流動(dòng)相:甲醇 －水(50∶50，V/V);檢測波長:270 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10 μL.

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取龍膽苦苷6 mg，加甲醇15 mL，配成400 μg/mL 的溶液待用.分別取0.125、0.375、0.625、1.5、2.5、5 mL加甲醇定容到10 mL，配成質(zhì)量濃度為5、15、25、60、100、200 μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液.按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖及峰面積，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程Y=9 864C+63 358(r=0.999 3)，結(jié)果表明龍膽苦苷在5～400 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，如圖1.

圖1 龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 龍膽苦苷PLGA納米粒的制備

2.2.1 制備方法

采用溶劑沉淀法制備龍膽苦苷PLGA納米粒.精密稱定龍膽苦苷，將龍膽苦苷加少量水溶解并與PLGA溶于丙酮和乙酸乙酯的混合溶液中，此混合物在磁力攪拌作用下，逐步加入含泊洛沙姆的水相中，一段時(shí)間后，有機(jī)溶劑擴(kuò)散進(jìn)水相.將制備好的GEN－PLGA倒入旋蒸瓶中，于40℃水浴中，采用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min，揮去有機(jī)溶劑，即得到GEN－PLGA －NP.

2.2.2 單因素考察

1)PLGA類型的選擇

用三種不同類型的PLGA按照2.2.1的制備方法，其他條件均不變的情況下制備納米粒，得出包封率和粒徑的數(shù)據(jù)，結(jié)果見表1.

表1 PLGA不同類型下包封率和粒徑的測定結(jié)果(n=3)

由表1可以看出，用不同類型的PLGA制備的納米粒子，粒徑無大差別，但分子質(zhì)量為50/50型號的PLGA制得的納米粒，包封率相對較高.

2)不同有機(jī)溶劑的選擇

其他條件不變的情況下，考慮有機(jī)溶劑對納米粒包封率和粒徑的影響，由文獻(xiàn)可知[7－8]，丙酮為適合水溶性藥物的有機(jī)溶劑，但單獨(dú)使用包封率較低，故選用混合有機(jī)溶劑，進(jìn)行研究，數(shù)據(jù)見表2.

表2 有機(jī)溶劑不同比例下的包封率和粒徑的測定結(jié)果(n=3)

由表2可以看出，丙酮與乙酸乙酯為1∶1時(shí)，納米粒的包封率最好.

3)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的PLGA的選擇

其他條件不變的情況下，考慮不同PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)對包封率和粒徑的影響，結(jié)果見表3.

表3 PLGA不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的包封率和粒徑的測定結(jié)果(n=3)

由表3可知，PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，納米粒包封率較高.

2.2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化處方

影響藥物包封率的因素很多，本文以2.2.1制備方法為基礎(chǔ)，選擇影響納米粒子制備的泊洛沙姆質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、內(nèi)水相與有機(jī)相體積比(C)、投藥量(D)這些影響較大的因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素分三個(gè)水平，見表4.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析結(jié)果見表5.對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表6.

表4 實(shí)驗(yàn)因素水平表

表5 PLGA正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果表

R表示極差，極差值越大，表示因素所起的作用越大.由表6可知，本實(shí)驗(yàn)中四個(gè)因素對包封率的影響結(jié)果為:D＞A＞C＞B.

表6 方差分析表

從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，最佳制備方案為:A2B2C3D1，而方差分析結(jié)果選出的最佳方案是:A2B1C3D1.顯然，正交實(shí)驗(yàn)的 9個(gè)方案中沒有A2B1C3D1這一方案，其是否為最佳方案，需要通過實(shí)驗(yàn)來證明.用A2B2C3D1方案和A2B1C3D1方案各做1次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，包封率分別為40.02%和52.86%.說明A2B1C3D1方案為最佳方案，即泊洛沙姆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，有機(jī)相與水相之比為1∶8，投藥量為3 mg.

2.3 龍膽苦苷PLGA納米粒的性質(zhì)表征

2.3.1 表觀形態(tài)觀察

取優(yōu)化后處方制備的GEN－PLGA分散體系1～2滴，通過0.45 μm 的濾膜過濾，滴于銅網(wǎng)上，干燥后滴入2%的磷鎢酸溶液，染色2～3 min，自然干燥，透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)，如圖2所示.

圖2 GEN－PLGA納米粒透射電鏡照片(×43000)

2.3.2 GEN－PLGA的粒徑與Zeta電位測定

將正交優(yōu)化后的GEN－PLGA樣品，配成適當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)后，用激光粒徑分布儀測定GEN－PLGA粒徑分布.測得平均粒徑為(131.3±3.2)nm，粒徑分散指數(shù)PDI值為0.248 ±0.02，Zeta電位為( －21.6 ±0.31)mV，見圖3、4.

2.3.3 GEN－PLGA的包封率和載藥量的測定

精密吸取1 mL龍膽苦苷PLGA納米?；鞈乙憾ㄈ葜? mL，在10 000 r/min離心20 min，然后取上清液過0.45 μm微孔濾膜.采用高效液相色譜法，10 μL進(jìn)樣記錄HPLC色譜測得峰面積，計(jì)算出上清液中游離藥物的質(zhì)量濃度，計(jì)算包封率和載藥量.包封率的計(jì)算公式如下:包封率(ER%)=(W0－W)/W0×100% 載藥量(DL%)=(W0－W)/M×100%其中:W是游離藥物質(zhì)量，W0為總投藥量，M是納米粒的質(zhì)量.通過以上公式計(jì)算出，GEN－PLGA 的載藥量為(2.44±1.45)%，包封率為(52.86 ±2.86)%.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了實(shí)驗(yàn)中各因素對納米粒成型的影響，首先是有機(jī)相的選擇，在制備過程中，藥物和聚合物一起溶于有機(jī)溶劑，需要根據(jù)藥物的性質(zhì)選擇合適的有機(jī)溶劑.其次是勻化強(qiáng)度，如果強(qiáng)度過小，有機(jī)相在水相中分散的不均勻，可由觀察其外觀獲知.對納米粒粒徑的影響，主要依賴于制備方法和材料的選擇.聚合物的黏度、有機(jī)相與水相比、表面活性劑的選擇均對粒徑大小有一定影響，但改變這些條件，粒徑變化不大.而制備過程中的勻化強(qiáng)度則為決定粒徑大小的因素，預(yù)實(shí)驗(yàn)中考察此條件時(shí)，當(dāng)強(qiáng)度過大時(shí)，粒徑小于100 nm，此時(shí)包封率極低，可能過大的強(qiáng)度破壞了藥物和聚合物形成的體系，導(dǎo)致包封率降低.

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