張?jiān)撇?劉海濤,趙雅坤

(中國(guó)石油大學(xué)(華東)環(huán)境與安全工程系,山東青島266580)

一株高效石油降解菌的紫外微波復(fù)合誘變改良

張?jiān)撇?劉海濤,趙雅坤

(中國(guó)石油大學(xué)(華東)環(huán)境與安全工程系,山東青島266580)

運(yùn)用紫外、微波復(fù)合誘變技術(shù),對(duì)高效石油降解菌KO5-2-11進(jìn)行改良,根據(jù)致死率曲線,選擇紫外誘變時(shí)間為100 s、微波誘變時(shí)間為45 s。經(jīng)過(guò)連續(xù)4次紫外誘變,得到紫外誘變改良菌UV2;將其作為微波誘變的出發(fā)菌株,經(jīng)2次微波誘變,最終得到遺傳穩(wěn)定的高效耐高溫石油降解菌UM2-6。比較KO5-2-11和UM2-6的溫度耐受性發(fā)現(xiàn),UM2-6的耐高溫性能良好,在55℃的高溫下仍具有27.42%的石油降解率,其最高石油降解率出現(xiàn)在45℃,達(dá)到48.72%,較KO5-2-11提高20.81%,改良效果明顯。

石油降解菌;耐高溫;紫外微波復(fù)合誘變;改良

新疆地區(qū)夏季高溫干旱,石油污染土壤日益嚴(yán)重,迫切需要高效的耐高溫石油降解菌進(jìn)行生物修復(fù)。作者運(yùn)用高效的紫外、微波復(fù)合誘變技術(shù)對(duì)現(xiàn)有菌種進(jìn)行改良,提高其溫度耐受性和最適生長(zhǎng)溫度,得到在高溫環(huán)境下石油降解效率較高的菌株,擬為高溫干旱地區(qū)的石油污染土壤修復(fù)提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

石油:采自新疆百口泉井區(qū),密度0.792 g· cm-3,粘度1923.14 mPa·s(50℃),飽和烴含量71.17%,芳香分含量18.42%,膠質(zhì)含量9.89%,瀝青質(zhì)含量0.52%。

OIL-510型全自動(dòng)紅外分光測(cè)油儀,北京華夏科創(chuàng)儀器技術(shù)有限公司;HZQ-QX型全溫振蕩器,哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;BCM-1000型生物凈化臺(tái)。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

菌種:從克拉瑪依石油污染土壤中篩選得到高效石油降解菌KO5-2-11,紅球菌屬,最適生長(zhǎng)溫度為30℃,最高耐受溫度為50℃。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)[1]:Na2HPO40.6 g, KH2PO40.2 g,Na NO34.0 g,MgSO40.3 g,CaCl20.01 g,FeSO40.01 g,酵母粉0.5 g,蒸餾水1000 mL, p H值7.0。

LB培養(yǎng)基(g·L-1):胰蛋白胨10.0,酵母浸出膏5.0,NaCl 5.0,瓊脂20.0(固體培養(yǎng)基用),p H值7.2～7.4。

1.3 方法

采用平板菌落計(jì)數(shù)法,統(tǒng)計(jì)誘變前后菌落數(shù),計(jì)算致死率,繪制致死率曲線,據(jù)其選擇合適的誘變時(shí)間。先將KO5-2-11菌懸液進(jìn)行紫外誘變,再將石油降解效果最好的紫外誘變菌株作為出發(fā)菌株進(jìn)行微波誘變,篩選得到復(fù)合誘變的改良菌。

1.4 石油降解率的測(cè)定

初始石油含量據(jù)培養(yǎng)基添加石油前后的質(zhì)量差獲得。培養(yǎng)后培養(yǎng)基中的石油含量采用全自動(dòng)紅外分光測(cè)油儀測(cè)定。測(cè)定參照GB/T16488-1996《水質(zhì)、石油類和動(dòng)植物油的測(cè)定-紅外光度法》,并稍做改進(jìn),采用循環(huán)水式真空泵將萃取液抽入抽濾瓶中。為了保證脫水效果,將無(wú)水Na2SO4的厚度加大為15 mm[2]。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外誘變改良

2.1.1 紫外誘變劑量的確定

向直徑9 cm的培養(yǎng)皿中加入濃度為1×108cfu ·m L-1的菌懸液5 m L,打開紫外燈,預(yù)熱20～30 min,在距離為80 cm、功率為15 W的2根紫外燈下照射后,吸取0.1 m L涂布于含油固體平板上,在50℃生化培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48 h,統(tǒng)計(jì)誘變前后的菌落數(shù)[3,4]。菌株的紫外誘變致死率如圖1所示。

圖1 紫外誘變致死率曲線Fig.1 The lethal rate curve for UV mutagenesis

研究發(fā)現(xiàn),正向突變多發(fā)生在低劑量的誘變中,因此,在誘變研究中,適宜使用致死率為70%～80%的相對(duì)劑量[5]。由圖1可知,隨著紫外誘變時(shí)間的延長(zhǎng),石油降解菌的致死率急劇上升;當(dāng)紫外誘變超過(guò)一定時(shí)間后,致死率上升緩慢直至幾乎不變。紫外誘變時(shí)間100 s的致死率為73.86%,介于最適致死率70%～80%之間,因此選擇紫外誘變時(shí)間為100 s。

2.1.2 紫外誘變菌種的篩選結(jié)果

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)連續(xù)4次紫外誘變以后,正突變率趨于穩(wěn)定,因此,選擇第4次紫外誘變時(shí)進(jìn)行篩選。初篩得到52株菌,挑選生長(zhǎng)旺盛的27個(gè)菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接,連續(xù)3次后,得到6株菌(編號(hào)UV1～UV6)[6],將它們移入100 m L石油含量為1%的無(wú)菌MSM培養(yǎng)基中,在160 r·min-1、50℃下暗室培養(yǎng)7 d,其對(duì)原油的降解現(xiàn)象及降解率如表1所示。

表1 紫外誘變菌株對(duì)石油的降解情況及降解率Tab.1 The phenomenon and petroleum degradation rate for UV mutagenesis strains

由表1可知,6株菌中,UV2的降解效果明顯好于其它5株菌,1%石油的降解率達(dá)到38.63%。因此,選擇UV2作為微波誘變的出發(fā)菌株。

2.2 微波誘變改良

2.2.1 微波誘變劑量的確定

將5 m L UV2菌懸液加入到10 m L試管中,用2450 MHz、800 W微波誘變處理,每隔5 s,置于冰上冷卻至室溫,如此交替進(jìn)行,誘變結(jié)束后,吸取0.1 m L涂布于含油固體平板上,然后在50℃生化培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48 h,統(tǒng)計(jì)誘變前后的菌落數(shù)[7,8]。菌株UV2的微波誘變致死率如圖2所示。

圖2 微波誘變致死率曲線Fig.2 The lethal rate curve for microwave mutagenesis

由圖2可知,隨著微波誘變時(shí)間的延長(zhǎng),石油降解菌的致死率急劇上升;當(dāng)微波誘變超過(guò)一定時(shí)間后,致死率上升緩慢直至幾乎不變。微波誘變40 s和50 s的致死率分別為69.39%和81.45%,因微波誘變劑量范圍應(yīng)使誘變致死率在70%～80%之間,因此選擇微波誘變時(shí)間為45 s。

2.2.2 微波誘變菌種的篩選結(jié)果

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)連續(xù)2次微波誘變以后,正突變率達(dá)到穩(wěn)定,因此,選擇第2次微波誘變時(shí)進(jìn)行篩選。初篩得到47株菌,挑選生長(zhǎng)旺盛的21個(gè)菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接,連續(xù)3次后,得到9株菌(編號(hào)UM2-1～UM2-9),將它們移入100 m L石油含量為1%的無(wú)菌MSM培養(yǎng)基中,在160 r·min-1、50℃下暗室培養(yǎng)7 d,其對(duì)原油的降解現(xiàn)象及降解率[9]如表2所示。

表2 微波誘變菌株對(duì)石油的降解情況及降解率Tab.2 The phenomenon and petroleum degradation rate for microwave mutagenesis strains

由表2可知,9株菌中,UM2-6的降解效果顯著高于其它8株菌,1%石油的降解率達(dá)到44.43%。將UM2-6轉(zhuǎn)接4次考察其遺傳穩(wěn)定性,培養(yǎng)7 d后石油的降解率穩(wěn)定在42.24%～44.79%之間,遺傳穩(wěn)定。因此,選擇UM2-6作為紫外、微波復(fù)合誘變的改良菌。

2.3 高效耐石油降解菌UM2-6的溫度耐受性

將KO5-2-11和UM2-6分別移入100 m L石油含量為1%的無(wú)菌MSM培養(yǎng)基中,在160 r·min-1條件下,分別于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃培養(yǎng)7 d,測(cè)定石油降解率,比較改良前后對(duì)溫度的耐受性[10],結(jié)果見圖3。

圖3 KO5-2-11和UM2-6的溫度耐受性比較Fig.3 Comparison of temperature tolerance between KO5-2-11 and UM2-6

由圖3可知,UM2-6在45℃時(shí)石油降解率達(dá)到最高,為48.72%,明顯高于KO5-2-11的27.91%;在50℃時(shí),KO5-2-11的石油降解率僅有14.29%,而UM2-6石油降解率為43.14%,仍具有明顯的石油降解能力;在55℃時(shí),KO5-2-11的石油降解率低至8.36%,基本喪失了石油降解能力,而UM2-6仍有27.42%的石油降解率,耐高溫性能良好。

3 結(jié)論

(1)以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的高效石油降解菌KO5-2-11為改良出發(fā)菌種,根據(jù)致死率曲線,確定紫外誘變時(shí)間為100 s、微波誘變時(shí)間為45 s,先后進(jìn)行4次紫外和2次微波復(fù)合誘變,最終改良得到遺傳穩(wěn)定的耐高溫石油降解菌UM2-6。

(2)對(duì)KO5-2-11和UM2-6進(jìn)行溫度耐受性比較,結(jié)果表明,UM2-6的耐高溫性能良好,在55℃的高溫下,仍具有27.42%的石油降解率,其最高石油降解率出現(xiàn)在45℃,達(dá)到48.72%,較KO5-2-11提高20.81%,改良效果明顯。

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UV-Microwave Mutagenesis Improvement on An Efficient Petroleum Degradation Strain

ZHANG Yun-bo,LIU Hai-tao,ZHAO Ya-kun
(Department of Environmental and Safety Engineering, China University of Petroleum,Qingdao 266580,China)

UV-Microwave mutagenesis technique was used to improve the efficient petroleum degradation strain KO5-2-11.Based on the lethal rate curves,the mutagenesis time of UV and microwave were determined as 100 s and 45 s,respectively.After the accumulation of UV mutagenesis for four times,the improved strain UV2 was achieved,which could be used as the original strain for microwave mutagenesis.After twice microwave mutagenesis,an efficient petroleum degradation strain UM2-6 with high genetic stability and thermostability was finally obtained.The thermostablity comparison between KO5-2-11 and UM2-6 showed that under the high temperature of 55℃,UM2-6 still had a petroleum degradation rate up to 27.42%with high heat tolerance,and the maximum petroleum degradation rate was 48.72%at 45℃,20.81%higher than that of KO5-2-11,showing obvious effect of improvement.

petroleum degradation strain;thermostable;UV-microwave mutagenesis;improvement

X 53

A

1672-5425(2013)07-0071-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.07.019

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(11CX06048A)

2013-04-16

張?jiān)撇?1965-),女,四川德陽(yáng)人,副教授,主要從事生物技術(shù)在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用研究。