黃 毅，袁小紅

(西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010)

離子交換層析分離混合氨基酸是生物化學(xué)或生物制藥工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中一個(gè)重要的制備實(shí)驗(yàn)。從20世紀(jì)80年代至今，國(guó)內(nèi)高校相關(guān)專業(yè)基本沿用兩套教學(xué)體系:第一套以檸檬酸－氫氧化鈉－鹽酸緩沖溶液(控制pH和鈉離子濃度)進(jìn)行樣品上樣，并以相同溶液進(jìn)行后續(xù)氨基酸洗脫［1－2］;第二套體系采用檸檬酸緩沖溶液作為平衡液進(jìn)行樹(shù)脂平衡及上樣，而后用氫氧化鈉溶液作為洗脫液進(jìn)行氨基酸樣品洗脫［3］。兩套體系均使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(如732樹(shù)脂)。通常用來(lái)分離的氨基酸包括賴氨酸、天冬氨酸、組氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸等。第一套方案簡(jiǎn)單快捷，但單一緩沖液上樣洗脫模式并未將離子交換技術(shù)的常規(guī)操作步驟融入到實(shí)驗(yàn)中，其原理及實(shí)驗(yàn)操作對(duì)該技術(shù)展現(xiàn)不完全，學(xué)生在學(xué)習(xí)過(guò)程中所獲知識(shí)較少;第二套體系展示了離子交換技術(shù)的基本原理并展現(xiàn)了改變pH進(jìn)行樣品洗脫這一常規(guī)離子交換分離方案，是較好的教學(xué)實(shí)驗(yàn)體系，國(guó)內(nèi)很多院校多采用此方案。經(jīng)多年使用，該方案雖然有所衍化提高，但筆者在這幾年的授課中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中仍然存在諸多問(wèn)題，比如實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定、結(jié)果解釋不清晰、學(xué)生疑問(wèn)較多及課程設(shè)置存缺陷等問(wèn)題。通過(guò)重新設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)授課方案并修改指導(dǎo)手冊(cè)，解決了以上問(wèn)題，提高了教學(xué)效果，現(xiàn)與同行分享，希望批評(píng)指正。

1 現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方案問(wèn)題

該實(shí)驗(yàn)一般采用苯乙烯性磺酸鈉型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(001×7，732型)作為分離介質(zhì)，分離的目標(biāo)混合氨基酸包括酸性氨基酸天冬氨酸(Asp，p I=2.97)，堿性氨基酸賴氨酸(Lys，p I=9.74)以及中性氨基酸丙氨酸(Ala，pI=6.02)等。為簡(jiǎn)便實(shí)驗(yàn)過(guò)程，常選擇前兩個(gè)氨基酸混合組成目標(biāo)分離溶液。實(shí)驗(yàn)中使用0.5 mol/L，pH=4.5～5.5的檸檬酸緩沖溶液作為平衡液平衡柱子，在樣品上樣后，繼續(xù)以該平衡液沖洗柱子從而以穿透峰形式洗脫出第一個(gè)氨基酸Asp。實(shí)驗(yàn)原理是利用4.5～5.5的環(huán)境pH低于Lys的pI值，Lys解離成陽(yáng)離子形式與樹(shù)脂的平衡離子發(fā)生交換而結(jié)合于柱上，而Asp解離成陰離子，不被吸附從而穿透流出層析柱。通過(guò)茚三酮反應(yīng)檢查第一個(gè)氨基酸穿透洗脫后，立刻改用pH約為11～13左右的氫氧化鈉溶液作為洗脫液沖洗柱子，此時(shí)柱中pH環(huán)境逐步升高并高于Lys的pI，其解離成陰離子狀態(tài)從而無(wú)法與樹(shù)脂結(jié)合而被洗脫下來(lái)。這樣，通過(guò)以上兩步操作就將混合氨基酸分離。雖然有部分作者修訂了該方法的部分問(wèn)題［4］，但實(shí)驗(yàn)中仍可能會(huì)遇到如下問(wèn)題:

1.1 茚三酮反應(yīng)結(jié)果不穩(wěn)定

因氨基酸無(wú)色，要檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須用氨基酸茚三酮顯色反應(yīng)。國(guó)內(nèi)權(quán)威生物化學(xué)教材已講明茚三酮在弱酸性溶液中與α－氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氨、脫羧，最后茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物氨和還原茚三酮發(fā)生作用，生成紫色物質(zhì)［5］。根據(jù)以上理論，茚三酮反應(yīng)必須保證在偏酸性環(huán)境下進(jìn)行，所以很多實(shí)驗(yàn)教材中都說(shuō)明在進(jìn)行該檢測(cè)時(shí)需在反應(yīng)體系里面加入少量醋酸或其他緩沖溶液以控制pH值［6］，特別是洗脫第二個(gè)氨基酸時(shí)所用洗脫液為氫氧化鈉溶液，就更需要將茚三酮反應(yīng)體系調(diào)到偏酸性，不然反應(yīng)的結(jié)果不會(huì)出現(xiàn)紫色，只會(huì)出現(xiàn)淡黃色［7］。而且pH對(duì)體系的影響其實(shí)不光是顯色，還包括顯色時(shí)間等［8］，由于學(xué)生個(gè)體在實(shí)驗(yàn)中加酸或緩沖溶液及加熱反應(yīng)時(shí)間的差異，會(huì)造成反應(yīng)結(jié)果出現(xiàn)一定偏差，無(wú)法較好地進(jìn)行教學(xué)和討論。

1.2 兩個(gè)洗脫的氨基酸無(wú)法分辨

雖然穿透洗脫和后面的加堿洗脫將兩個(gè)氨基酸都分別洗脫分離，但由于顯色體系一樣，結(jié)果都呈現(xiàn)藍(lán)紫色，無(wú)法表觀分辨到底是哪個(gè)氨基酸先洗出哪個(gè)后洗出，授課時(shí)只能根據(jù)理論解釋第一個(gè)是Asp，第二個(gè)是Lys。如要證明，必須補(bǔ)加紙層析等其他實(shí)驗(yàn)。顯然這對(duì)部分求知欲較強(qiáng)的學(xué)生來(lái)說(shuō)，該實(shí)驗(yàn)是不完善的。

1.3 教學(xué)設(shè)計(jì)存在一定缺陷

該實(shí)驗(yàn)主要是讓學(xué)生掌握離子交換技術(shù)的基本理論及實(shí)驗(yàn)操作。理論教學(xué)中已經(jīng)說(shuō)明離子交換樹(shù)脂分離化合物是利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異來(lái)進(jìn)行物質(zhì)分離的。分離方式包括兩種:一種是通過(guò)改變pH值從而改變兩性電解質(zhì)帶電荷狀況，以完成樣品與色譜柱的吸附和解析;另一種是利用質(zhì)量作用定律采用其他高強(qiáng)度離子進(jìn)行取代分離［9］。以上實(shí)驗(yàn)只應(yīng)用了第一種分離方式，實(shí)際上第二種方式在離子交換技術(shù)中的應(yīng)用更廣泛、更深入。這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)缺陷會(huì)使學(xué)生學(xué)習(xí)結(jié)束后形成離子交換分離主要依靠pH值控制這一狹隘認(rèn)識(shí)。

2 解決辦法

為解決以上問(wèn)題，筆者通過(guò)文獻(xiàn)檢索及多次實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了如下改進(jìn):

1)將常用的強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂更換為苯乙烯性季銨型陰離子交換樹(shù)脂(201×7，717型)。該樹(shù)脂和原732樹(shù)脂價(jià)格基本無(wú)差異，因此不影響實(shí)驗(yàn)預(yù)算;

2)在樹(shù)脂用酸堿處理結(jié)束并改型后直接置于蒸餾水中浸泡備用。學(xué)生裝柱時(shí)直接用蒸餾水浸泡的樹(shù)脂裝柱，裝柱結(jié)束后無(wú)需用檸檬酸緩沖液平衡就可進(jìn)行樣品上樣，然后直接用蒸餾水洗脫，可得到穿透洗脫的Lys;

3)第一個(gè)氨基酸穿透洗脫后，用pH=4.5～5.5的檸檬酸緩沖溶液進(jìn)行洗脫，可洗脫第二個(gè)氨基酸Asp。

該方案的設(shè)計(jì)原理是利用蒸餾水pH為中性，在中性環(huán)境下Lys帶正電荷，不能和陰離子樹(shù)脂上的平衡離子交換，無(wú)法結(jié)合于柱上，直接穿透洗脫;而后在pH=4.5～5.5的檸檬酸緩沖溶液環(huán)境下，雖然Asp仍然帶負(fù)電荷，但檸檬酸根是離子強(qiáng)度較強(qiáng)的陰離子，可以利用質(zhì)量作用定律將Asp置換下來(lái)。

3 新方案優(yōu)點(diǎn)

1)因樹(shù)脂直接在蒸餾水中浸泡，裝柱及穿透洗脫均用蒸餾水，去掉了原有緩沖液平衡一步，減少了前期實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備及實(shí)驗(yàn)過(guò)程時(shí)間。

2)兩次洗脫氨基酸的環(huán)境分別處于中性(蒸餾水)和偏酸性環(huán)境(pH=4.5～5.5檸檬酸緩沖溶液)，因此進(jìn)行茚三酮顯色反應(yīng)時(shí)不再需要添加乙酸或醋酸緩沖溶液等pH調(diào)節(jié)試劑，這樣就減少了學(xué)生實(shí)驗(yàn)中添加酸性緩沖溶液的個(gè)體誤差。

3)洗脫氨基酸便于分辨。由于Lys在中性環(huán)境下的茚三酮反應(yīng)為紫紅色，Asp在偏酸性環(huán)境下的茚三酮反應(yīng)為藍(lán)紫色，對(duì)照文獻(xiàn)，學(xué)生可明確知道第一個(gè)洗脫的是Lys，第二個(gè)洗脫的是Asp［10］。

4)授課過(guò)程中，學(xué)生除了知道了pH值調(diào)整是離子交換技術(shù)一個(gè)重要技術(shù)手段外，更清楚質(zhì)量作用定律下離子強(qiáng)度的重要。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中學(xué)生帶著“為什么Asp帶負(fù)電荷依然能從陰離子交換樹(shù)脂上被洗脫”的問(wèn)題進(jìn)行，增加了思考，全面掌握了離子交換技術(shù)的兩種常用洗脫方法。

4 結(jié)束語(yǔ)

在改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)器材、上樣量等均無(wú)更改，只是更換了樹(shù)脂、平衡溶液和洗脫液，減少了平衡液平衡過(guò)程及NaOH洗脫液配置。這不只是減少了老師前期準(zhǔn)備工作量、時(shí)間、學(xué)生實(shí)驗(yàn)時(shí)間及部分實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，還優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，使學(xué)生實(shí)驗(yàn)做得暢快，理論學(xué)得更扎實(shí)。另外可在實(shí)驗(yàn)課程中分組同時(shí)運(yùn)用新舊兩種方法，使學(xué)生體會(huì)到書(shū)本上的實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)方法并非是固化的，可以根據(jù)所掌握的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和理論知識(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行大膽的探索與實(shí)踐，從問(wèn)題中來(lái)到問(wèn)題中去。這樣既有利于啟迪學(xué)生的創(chuàng)新思維，又有利于培養(yǎng)學(xué)生解決問(wèn)題的能力，為將來(lái)的實(shí)際工作打好基礎(chǔ)。修改后的指導(dǎo)書(shū)還將該實(shí)驗(yàn)升級(jí)，將兩種氨基酸混合液轉(zhuǎn)換為蛋白水解物［11］，與實(shí)踐結(jié)合更緊密，增加了實(shí)驗(yàn)難度，可作為學(xué)生創(chuàng)新綜合性實(shí)驗(yàn)開(kāi)出，更好地鍛煉學(xué)生的動(dòng)腦動(dòng)手能力。實(shí)驗(yàn)［M］.北京:高等教育出版社，1982.

［2］董曉燕.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.2版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2008.

［3］宋方州，何風(fēng)田.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:科學(xué)出版社，2008.

［4］張紅梅，盂新云，官守濤.氨基酸離子交換色譜實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)［J］.鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，25(1):42.

［5］王鏡巖.生物化學(xué)［M］.3版.北京:高等教育出版社，2000.

［6］陳忠云.α－氨基酸和茚三酮顯色反應(yīng)機(jī)理［J］.教材通訊，1991(2):36－37.

［7］陸珊華，孫愛(ài)民.離子交換樹(shù)脂層析分離混合氨基酸［J］.南京醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1989，9(4):307.

［8］張振華.α－氨基酸與茚三酮顯色反應(yīng)影響因素的探討［J］.邵陽(yáng)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2000，13(1):42－44.

［9］吳梧桐，高向東.生物制藥工藝學(xué)［M］.2版.南京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2004.

［10］張鑒棠，湯秀玉，韓紅.不同PH對(duì)氨基酸與茚三酮呈色反應(yīng)的影響［J］.南京鐵道醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1992，11(2):126－128.

［11］胡瓊英，狄洌，聶理，等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007.