邵美麗，陳慧燕，李 娜

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

豆渣是大豆制品產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物，目前有關(guān)豆渣的深加工利用非常局限，主要集中在膳食纖維、異黃酮和維生素E 等活性物質(zhì)的開發(fā)方面［1-3］。隨著大豆產(chǎn)量的不斷增加和大豆加工行業(yè)的迅速發(fā)展，豆渣的綜合利用和深度開發(fā)成為急需解決的問題。核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)是細(xì)胞內(nèi)的重要成分，研究表明核糖核酸及核糖核苷酸對(duì)免疫系統(tǒng)正常功能、腸道生長(zhǎng)發(fā)育、肝組織功能及脂代謝都有重要影響［4-8］。我國(guó)可提供的核酸資源較單一，工業(yè)上主要以廢啤酒酵母作為原料提取RNA，但由于獲取原料困難，不能滿足市場(chǎng)需要［9］。而豆渣中的核酸含量也不亞于酵母核酸，且豆渣價(jià)格低廉，來(lái)源豐富，是天然優(yōu)質(zhì)的核酸資源［10］。故本實(shí)驗(yàn)室開展了有關(guān)豆渣RNA 制備、酶解及其功能方面的研究。本文主要利用實(shí)驗(yàn)室前期制備好的豆渣RNA［11］及其酶解物，研究二者對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫、體液免疫及非特異性免疫功能的影響，并比較二者免疫調(diào)節(jié)作用的差異，以期為豆渣資源的深度開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Balb/c 小白鼠(清潔級(jí)，8 周齡，體重(18 ±2)g，雌雄各半) 哈爾濱獸醫(yī)研究所;豆渣RNA 及其酶解物 實(shí)驗(yàn)室自制;刀豆蛋白A 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;四甲基偶氮唑鹽 天津博迪化工股份有限公司;RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;小牛血清 杭州四季青生物工程公司;SRBC 哈爾濱獸醫(yī)研究所;豚鼠補(bǔ)體 實(shí)驗(yàn)室自制;印度墨汁 北京市西中化工廠。

BIO RAD 680 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 美國(guó)Labconco公司;TE2000 倒置顯微鏡 OLYMPUS 公司;MR23i低溫冷凍離心機(jī) 法國(guó)Jouan 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 小白鼠隨機(jī)分為7 組，分別為正常對(duì)照組(生理鹽水)、豆渣RNA 高劑量組(10.0mg/mL)、豆渣RNA 中劑量組(1.0mg/mL)、豆渣RNA 低劑量組(0.1mg/mL)、豆渣RNA 酶解物高劑量組(10.0mg/mL)、豆渣RNA 酶解物中劑量組(1.0mg/mL )、豆渣 RNA 酶解物低劑量組(0.1mg/mL)。每組12 只，雌雄各半。每只每日灌胃0.5mL 受試物，連續(xù)30d，自由采食和飲水。

1.2.2 臟器指數(shù)的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［12］，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死小鼠，取胸腺和脾臟，用濾紙吸干表面血污，分別稱重，并按公式計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)。計(jì)算公式如下:

1.2.3 脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(MTT 法) 參照文獻(xiàn)［13］，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，無(wú)菌取小鼠脾臟，置于平皿內(nèi)200目的不銹鋼網(wǎng)上。用注射器針芯研磨，加入RPMI1640 培養(yǎng)液沖洗。將上述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入2 倍體積的淋巴細(xì)胞分離液，1000r/min 離心10min，吸取中間的白膜層(單個(gè)核細(xì)胞層)，用RPMI1640 培養(yǎng)液洗滌2 次后，計(jì)數(shù)，并調(diào)整濃度至1 ×106/mL。

將上述制備的脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24 孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，其中一孔加ConA(5.0μg/mL)，另一孔作對(duì)照，置5% CO2，37℃CO2孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔吸取上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL 酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3 個(gè)平行孔，測(cè)OD570值，用加ConA 孔的光密度值減去不加ConA 孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.2.4 小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［14］，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用20%(v/v)SRBC 懸液注射在小鼠右側(cè)足墊皮下，每鼠50μL，同時(shí)左側(cè)注射50μL 生理鹽水。24h 后，用游標(biāo)卡尺測(cè)定小鼠左右足墊厚度，以左右足墊厚度之差為腫脹程度，同一部位測(cè)量3 次，取平均值。

1.2.5 小鼠脾抗體生成細(xì)胞檢測(cè)(定量溶血分光光度法) 參照文獻(xiàn)［15］，于實(shí)驗(yàn)第26d，向小鼠腹腔注射2%綿羊紅細(xì)胞(SRBC)0.2mL。第30d 處死小鼠，取脾臟并按照1.2.3 方法制備脾細(xì)胞懸液。然后取脾細(xì)胞懸液1mL，依次加入補(bǔ)體和0.2% SRBC 各1mL，于37℃溫浴1h，3000r/min 離心10min，取上清，測(cè)OD413值。

1.2.6 單核-巨噬細(xì)胞功能的測(cè)定(碳廓清實(shí)驗(yàn))參照文獻(xiàn)［16］，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，小鼠尾靜脈注射稀釋的印度墨汁0.05mL。并分別于2、10min 后內(nèi)毗靜脈叢采血2μL，并將血樣迅速吹到2mL 的0.1%碳酸鈉溶液中，然后測(cè)OD619值。按照下列公式計(jì)算碳粒廓清指數(shù)K 及吞噬指數(shù)α。

OD1:2min 時(shí)的吸光值;OD2:10min 時(shí)的吸光值;t1:2min;t2:10min。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠免疫器官重量的影響

胸腺和脾臟是機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官，與機(jī)體的細(xì)胞、體液免疫關(guān)系密切。當(dāng)對(duì)機(jī)體使用免疫增強(qiáng)劑時(shí)會(huì)增加胸腺和脾臟的重量，故在一定程度上，胸腺和脾臟的重量可反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱，因此測(cè)量其重量可作為判斷機(jī)體免疫功能的輔助指標(biāo)［17］。豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠免疫器官的影響如圖1 所示。

圖1 豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠免疫器官重量的影響Fig.1 Effect of okara RNA and hydrolysates on viscera index in mice

由圖1 可知，豆渣RNA 及其酶解物組各劑量組的胸腺指數(shù)雖然較對(duì)照組有所增加，但無(wú)顯著性差異(p ＞0.05)，表明豆渣RNA 及其酶解物對(duì)胸腺無(wú)明顯影響。而豆渣RNA 及其酶解物組各劑量組的脾臟指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(p ＜0.05)，其中酶解物中、高劑量組極顯著高于對(duì)照組(p ＜0.01)。同時(shí)，酶解物高劑量還極顯著高于RNA 各劑量組(p ＜0.01)，表明豆渣RNA 及其酶解物均可明顯促進(jìn)小鼠脾臟生長(zhǎng)，并在劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，其中酶解物高劑量組效果最優(yōu)。

2.2 豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響

脾臟是各類免疫細(xì)胞居住的場(chǎng)所，也是對(duì)抗原物質(zhì)產(chǎn)生免疫及產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)的重要基地。伴刀球蛋白(con A)可以選擇性地刺激T 淋巴細(xì)胞使之增殖，因此通過測(cè)定伴刀球蛋白誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖能力可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能［18］。豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響如圖2 所示。

圖2 豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of okara RNA and hydrolysates on lymphocyte transformation in mice

由圖2 可以看出，與對(duì)照組相比，豆渣RNA 及其酶解物各劑量組均能顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力(p ＜0.05)，而且二者均呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。其中，酶解物高劑量組極顯著高于對(duì)照組(p ＜0.01)，同時(shí)它還顯著高于RNA 各劑量組(p ＜0.05)，表明豆渣RNA 及其酶解物均能明顯提高小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力，增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能，其中酶解物高劑量組的效果最顯著。

2.3 豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

DTH(遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng))是檢測(cè)T 細(xì)胞功能的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法之一，通過測(cè)定受測(cè)物對(duì)機(jī)體遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響，可反映機(jī)體的T 細(xì)胞功能或受試物的作用［19］。豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響如圖3 所示。

圖3 豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)影響Fig.3 Effect of okara RNA and hydrolysates on delayedtype hypersensitivity in mice

由圖3 可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的豆渣RNA 及其酶解物30d 后，盡管豆渣RNA 組及其酶解物各劑量組的足趾增厚值比對(duì)照組有所增加，但未達(dá)到顯著性水平(p ＞0.05)，說明豆渣RNA 及其酶解物對(duì)T 細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響不明顯。

2.4 豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠脾臟抗體生成細(xì)胞的影響

脾臟的抗體生成細(xì)胞水平是反映機(jī)體體液免疫功能的重要指標(biāo)之一［10］。豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠脾臟抗體生成細(xì)胞的影響如圖4 所示。

圖4 豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠脾臟抗體形成細(xì)胞的影響Fig.4 Effect of okara RNA and hydrolysates on the antibody forming cell in mice

由圖4 可以看出，豆渣RNA 組及其酶解物各劑量組小鼠的脾臟抗體生成細(xì)胞水平均高于對(duì)照組。其中，豆渣RNA 各劑量組與對(duì)照組相比，差異不顯著(p ＞0.05)，而豆渣RNA 酶解物各劑量組則顯著高于對(duì)照組(p ＜0.05)，且酶解物高劑量組極顯著高于對(duì)照組(p ＜0.01)，同時(shí)顯著高于RNA 各劑量組(p ＜0.05)，并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。表明豆渣RNA酶解物可明顯增加脾臟的抗體生成細(xì)胞水平，增強(qiáng)小鼠的體液免疫功能。其中酶解物高劑量組的效果最好。

2.5 豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響

巨噬細(xì)胞是機(jī)體天然免疫防御系統(tǒng)中重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其吞噬功能可反映機(jī)體非特異性免疫功能的強(qiáng)弱［21］。豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響如圖5 所示。

圖5 豆渣RNA 及其酶解物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響Fig.5 Effect of okara RNA and hydrolysates on ability of carbon clearance in mice

由圖5 可知，與對(duì)照組相比，豆渣RNA 及其酶解物各劑量組吞噬指數(shù)雖有所提高，但差異不顯著(p ＞0.05)，表明豆渣RNA 及其酶解物不能明顯促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提示豆渣RNA 及其酶解物對(duì)機(jī)體的非特異性免疫調(diào)節(jié)作用不明顯。

3 討論

研究表明RNA 是維持機(jī)體正常免疫功能的必需營(yíng)養(yǎng)成分。補(bǔ)充外源性RNA，不僅可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，還能恢復(fù)由蛋白質(zhì)缺乏或其他原因引起的免疫功能喪失［22］。豆渣RNA 作為一種新的RNA 資源，其免疫活性如何，尚未見報(bào)道。本研究依照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》的要求，分別從免疫器官重量、細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞功能4 個(gè)方面探討了豆渣RNA 及其酶解物在不同劑量水平下對(duì)小鼠免疫功能的影響，并比較了二者免疫調(diào)節(jié)作用的差異。

本實(shí)驗(yàn)表明豆渣RNA 及其酶解物均能促進(jìn)小鼠脾臟生長(zhǎng)，增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞增殖能力，提高小鼠脾臟細(xì)胞的抗體生成水平，二者均呈現(xiàn)劑量依賴性。這說明豆渣RNA 及其酶解物可通過提高小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫增強(qiáng)機(jī)體的整體免疫能力。此結(jié)果與王蘭芳等研究日糧中添加核苷酸能極顯著提高免疫抑制小鼠的抗體形成細(xì)胞的數(shù)目和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的結(jié)果相似［23］。

豆渣RNA 與豆渣RNA 酶解物相比，在增強(qiáng)脾臟指數(shù)，淋巴細(xì)胞增殖能力和抗體生成量方面，RNA 酶解物的高劑量組顯著優(yōu)于RNA 其他各劑量組，RNA酶解物的中、低劑量組較相對(duì)應(yīng)的RNA 中、低劑量組雖然也有提高，但差異不顯著。這說明豆渣RNA酶解中小分子的低聚寡核苷酸可能更加易于小腸吸收，所以酶解物組的免疫效果相比非酶解物組好，但RNA 酶解物高劑量組(10.0mg/mL)的效果最明顯。

此外，本實(shí)驗(yàn)表明豆渣RNA 及其酶解物不能明顯促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能。且豆渣RNA 及其酶解物各劑量組吞噬指數(shù)未呈現(xiàn)劑量依賴性。豆渣RNA 組出現(xiàn)隨劑量增加，吞噬指數(shù)逐漸降低的趨勢(shì)，推測(cè)可能因劑量過大造成機(jī)體短期刺激過大，影響其炭粒廓清能力，導(dǎo)致吞噬指數(shù)降低。豆渣RNA酶解物組則出現(xiàn)隨劑量增加，吞噬指數(shù)先降低后增加的趨勢(shì)，此原因有待于下一步在本實(shí)驗(yàn)劑量(0.1～10.0mg/mL)范圍內(nèi)，減小劑量設(shè)計(jì)倍數(shù)，增加實(shí)驗(yàn)組數(shù)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)后分析探討。

4 結(jié)論

豆渣RNA 及其酶解物均能促進(jìn)小鼠脾臟生長(zhǎng)，增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞增殖能力，提高抗體生成細(xì)胞水平，但對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能影響不明顯。這表明豆渣RNA 及其酶解物主要通過促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。其中，豆渣RNA 酶解物高劑量組(10.0mg/mL)的效果明顯優(yōu)于豆渣RNA 組。

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