陳國華 ，弭寶彬，李 瑩，李春月

(1.中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081;2.中南大學研究生院隆平分院，長沙 410125;3.北華大學林學院，吉林 132013;4.吉林省白山市靖宇縣第一中學，白山 134300)

土壤細菌是土壤中數(shù)量最豐富、分布最廣泛的微生物類群，它占土壤微生物總量的70%—90%。土壤細菌廣泛參與土壤有機質積累、營養(yǎng)元素循環(huán)過程，其多樣性和活性是保持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的基礎。土壤細菌對外界干擾比較敏感，是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預警指標，常用于研究轉基因作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響，評價轉基因作物的安全性。目前，很多科學家針對轉Bt基因作物對土壤微生物多樣性和生物活性的影響進行大量研究［1-4］，以揭示Bt蛋白對土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全性。轉基因作物對土壤微生物的影響由轉基因作物釋放到土壤中的外源蛋白的化學和生物學特性引起的，或者由轉基因植株的生理生化特性改變造成的［5］。隨著RNAi技術的發(fā)展，利用表達雙鏈RNA的RNA干擾作用來防治病蟲害的轉基因作物越來越多。相對于表達外源蛋白的轉基因作物來說，表達雙鏈RNA的轉基因植物對土壤微生物的影響可能會通過分泌RNA對土壤微生物起作用。目前，針對表達雙鏈RNA的轉基因作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)安全性的研究未見報道。

陳國華等利用RNAi技術成功地沉默了線蟲mapk基因，致使南方根結線蟲的生長發(fā)育受阻而導致死亡，并成功的構建了表達mapk雙鏈RNA的轉基因黃瓜植株，通過黃瓜表達mapk的雙鏈RNA沉默根結線蟲的mapk基因，對根結線蟲具有良好的防治效果［6］。MAPK信號途徑在生物中廣泛存在，為了明確mapk雙鏈RNA的轉基因黃瓜植株是否對根際土壤細菌具有影響，本研究采用細菌16S rRNA基因克隆文庫方法對種植轉基因黃瓜根際土壤和非轉基因黃瓜根際土壤的細菌群落類群多樣性進行分析，以期為轉基因植物對土壤微生物的風險評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及材料

試驗田位于中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所溫室基地。供試黃瓜品種為新泰密刺，轉基因黃瓜材料轉入MiMPK1基因片段dsRNA表達載體，非轉基因黃瓜為普通新泰密刺。試驗田連續(xù)種植轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜3a，種植方式為一年兩茬輪作。黃瓜正常管理施肥。

1.2 土壤取樣方法

土壤取樣時間為2012年6月14日和下半年9月14旬，為黃瓜結果期。兩次土壤樣品混合在一起。土壤取樣采用五點采樣法，用土壤采樣器采集10株黃瓜根系5cm范圍內黃瓜根際土壤，采集深度為0—15 cm的土樣，混合后用密封袋帶回，土樣用2 mm孔徑篩網(wǎng)過篩，去除顆粒硬物和黃瓜根系。

1.3 土壤微生物DNA提取

采用土壤總DNA提取試劑盒(美國MOBIO公司)提取土壤微生物DNA。按照試劑盒說明書，分別提取轉基因黃瓜土壤和非轉基因黃瓜土壤DNA，每個處理分別提取5份土壤微生物DNA，分別混合，經(jīng)電泳和分光光度計檢測DNA質量，-20℃保存。

1.4 16S rRNA基因克隆文庫構建

采用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACTTGTTACG ACTT-3')［7］從土壤微生物DNA中擴增16S rRNA基因。PCR反應體系20 μL，具體如下:1 μL DNA模板 (100ng)，0.5μmol/L引物，0.2 mmol dNTPs，5 units of EasyTaq DNA聚合酶、1×反應緩沖液，13.7μL dd水。為了減少擴增偏嗜性，采用梯度PCR程序進行擴增，且重復5次，將PCR產物混合。PCR反應程序如下:95℃ 4 min;95℃ 30 s，52℃至58℃ 30 s，72℃ 2 min，30 個循環(huán);72℃ 10 min。

將PCR產物經(jīng)電泳檢測，割膠純化，連接入PGM-T載體(天根生化科技有限公司)，轉化Top10感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術有限公司)，在涂有IPTG和X-gal的安芐青霉素LB平板上進行藍白斑篩選，隨機200個挑取白色克隆構成16S rRNA基因文庫，將克隆培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基(安芐青霉素50 μg/mL)中振蕩培養(yǎng)8 h，菌液PCR進行陽性克隆鑒定，采用引物為T7和SP6。隨機挑取150個陽性克隆送諾塞基因公司測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Chimera Check程序將所得16S rRNA基因序列在RDP(Ribosomal Database Project)數(shù)據(jù)庫進行嵌合體檢驗，去除嵌合體序列。以97%為劃定閾值，用DOTUR軟件包對16S序列劃分操作分類單元(OTU)，并構建稀缺性曲線［8］。

多樣性指數(shù)依據(jù)下列公式進行計算［9］:

式中，pi代表每個物種樣本數(shù)量占總樣本數(shù)量的比例。

均勻度: 式中，豐富度(S)是樣本中物種的數(shù)量，這里等同OTU的數(shù)量。

2 結果與分析

2.1 轉基因黃瓜土壤和非轉基因黃瓜土壤細菌類群

非轉基因黃瓜根際土壤細菌16S rRNA克隆文庫測序150個克隆，以97%劃分OTU，獲得124個OTU。轉基因黃瓜土壤細菌16S rRNA克隆文庫測序150個克隆，獲得122個OTU。兩個文庫共同包含的克隆共有115個，這表明兩個文庫細菌類群比較一致。

轉基因黃瓜根際土壤細菌分為 13個類群(圖 1A):Acidobacteria、Actinobacteria、Armatimonadetes、Bacteroidetes、candidate division BRC1、Chloroflexi、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Nitrospira、Planctomycetes、Proteobacteria、Verrucomicrobia、unclassified_Bacteria。Proteobacteria 為 優(yōu) 勢 種 群，占 24.1%;其 次 為Bacteroidetes，占19.0%，再次為Chloroflexi，占16.8%;Acidobacteria占11.7%，其他種群比例相對較低。這表明轉基因黃瓜土壤中，優(yōu)勢細菌類群為Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi和Acidobacteria，而其他細菌類群為非優(yōu)勢菌群。

非轉基因黃瓜根際土壤細菌分為14個類群(圖1B):Acidobacteria、Actinobacteria、Armatimonadetes、Bacteroidetes、 BRC1、 Chloroflexi、 Cyanobacteria/Chloroplast、 Firmicutes、 Gemmatimonadetes、 Nitrospira、Planctomycetes、Proteobacteria、Verrucomicrobia、unclassified_Bacteria。其中 Proteobacteria 是優(yōu)勢菌群，占22.8%;其次為Bacteroidetes，占19.9%;Chloroflexi占17.6%，Acidobacteria占10.3%，其他類群數(shù)量相對較少。這表明在非轉基因黃瓜土壤中，優(yōu)勢細菌類群為Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi和Acidobacteria，而其他細菌類群為非優(yōu)勢菌群。

2.2 轉基因黃瓜土壤和非轉基因黃瓜土壤細菌多樣性比較

轉基因黃瓜土壤和非轉基因黃瓜土壤細菌類群差別不大，13個類群細菌為兩種土壤所共有，轉基因黃瓜土壤缺少Cyanobacteria/Chloroplast細菌類群，而該類群細菌在非轉基因黃瓜土壤比例很低，僅僅為0.7%。在優(yōu)勢細菌類群上，轉基因黃瓜土壤和非轉基因黃瓜土壤基本一致，Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi和Acidobacteria均為優(yōu)勢細菌類群，但在比例上存在細微差別。轉基因黃瓜土壤中，Proteobacteria和Acidobacteria的比例略高于非轉基因黃瓜土壤，而Bacteroidetes和Chloroflexi的比例略低于非轉基因黃瓜土壤。總體來看，兩種土壤細菌類群無顯著差異。

圖1 文庫各門細菌比例Fig.1 Proportions of bacteria in two libraries at phylum

圖2 轉基因黃瓜土壤和非轉基因黃瓜土壤細菌類群比較Fig.2 Comparison of bacteria groups between transgenic cucumber soil and non-transgenic cucumber soil

在綱分類水平上，兩種土壤的優(yōu)勢細菌類群差異也不大(圖3)。在Acidobacteria門細菌中，兩種土壤包含6 個綱的細菌，Acidobacteria_Gp3、Acidobacteria_Gp4、Acidobacteria_Gp5、Acidobacteria_Gp6、Acidobacteria_Gp25和 unclassified Acidobacteria，其中 Acidobacteria_Gp6為優(yōu)勢菌群。在 Bacteroidetes門中，包含Bacteroidetes_incertae_sedis、Flavobacteria、Sphingobacteria 和unclassified Bacteroidetes，其中Sphingobacteria 綱細菌數(shù)量最多。在Chloroflexi門細菌中，兩種土壤的unclassified Chloroflexi細菌最多，這表明土壤中存在大量的細菌新類群。在Proteobacteria門細菌類群中，兩種土壤細菌分屬于Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria和Gammaproteobacteria，其中Betaproteobacteria綱的細菌數(shù)量最多，Deltaproteobacteria細菌數(shù)最少。

圖3 綱分類水平上兩種土壤優(yōu)勢細菌類群比較Fig.3 Comparison of the dominant bacteria groups in two libraries at class level

從多樣性指數(shù)來看(表1)，轉基因黃瓜土壤和非轉基因黃瓜土壤的細菌群落差異不大。Shannon評價一個群落物種多樣性，其值越高，表明群落的物種多樣性越高。兩種土壤的Shannon指數(shù)均為4.6，這表明兩種土壤細菌多樣性無顯著差別。Simpson也是描述群落物種多樣性的指數(shù)，兩種土壤細菌的Simpson指數(shù)差異不大，也反映出兩種土壤細菌的多樣性差異不大。Chao是描述群落豐富度的指數(shù)，其值越高表明群落物種的豐富度越高。非轉基因黃瓜土壤細菌群落的Chao高于轉基因黃瓜土壤，這表明非轉基因黃瓜土壤細菌的豐度略高于轉基因土壤。

表1 轉基因黃瓜土壤和非轉基因黃瓜土壤細菌多樣性指數(shù)Table 1 The index of diversity of two libraries

3 討論

隨著基因工程技術的不斷發(fā)展，利用RNAi技術培育抗病新品種更是有效的植物病害防治方法。Yadav等將編碼根結線蟲特異聯(lián)接因子和整合酶的管家基因的雙鏈RNA表達載體轉入煙草，表達dsRNA的轉基因煙草對根結線蟲具有很高抗性，證實利用RNAi方法控制植物寄生害蟲是一個十分有效的策略［10］。本研究采用的轉基因黃瓜材料能夠表達mapk的雙鏈RNA，能夠靶向的抑制根結線蟲mapk基因的表達，有效控制根結線蟲的侵染，具有廣闊的應用前景［6］。然而，針對該轉基因植物的生態(tài)安全性還未進行研究。

土壤細菌作為土壤中最豐富的微生物，其種群多樣性和功能多樣性對土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義。因此，評價轉基因作物的安全性必須考慮轉基因產物對土壤細菌的影響。目前，針對轉Bt和抗除草劑基因的轉基因作物安全性進行了大量研究［11-12］，有些研究表明轉基因作物對土壤微生物群落產生了顯著影響［13］，有些研究得出相反的結論［14］。轉Bt植物在生長過程中產生的Bt蛋白會以根系分泌物的形式進人到土壤中，并牢牢結合在土壤顆粒中難以降解，最終對土壤微生物造成影響。迄今為止，針對雙鏈RNA在土壤中的殘留動態(tài)情況和雙鏈RNA轉基因植物的生態(tài)安全性研究未見報道。

從本研究結果來看，轉mapk雙鏈RNA黃瓜并未對根際土壤細菌群落產生明顯的影響。造成這種情況，可能基于4個方面的原因:(1)外源的雙鏈RNA表達特異性，它們只能在植物的細胞內表達［15］。未有研究表明雙鏈RNA能夠分泌到植物體表。(2)雙鏈RNA發(fā)揮作用需要依賴真核生物的Dicer酶［16］，而細菌不具有Dicer酶，雙鏈RNA無法對細菌起作用。(3)雙鏈RNA只針對同源性較高的靶基因起RNA干擾作用［16］，細菌不具有與mapk同源的基因。(4)土壤環(huán)境樣品中RNA酶含量豐富，RNA易被降解［17］。即使分泌到植物體外的雙鏈RNA也會很快被土壤RNA酶降解。由于轉基因黃瓜的mapk雙鏈RNA特性和土壤環(huán)境的影響，使得轉基因黃瓜對根際土壤細菌群落的影響較小，而溫室的特殊環(huán)境對土壤細菌的影響可能更大。

本研究中土壤取自黃瓜連作溫室，溫室環(huán)境特殊，如高溫高濕、高有機質含量、高復種指數(shù)，這會對土壤微生物群落產生一定的影響。黃瓜連作田土壤微生態(tài)環(huán)境產生顯著改變，導致微生物種群平衡遭受破壞，根際微生態(tài)平衡的失調［18］，且黃瓜根際細菌種類和數(shù)量變化與黃瓜根分泌物密切相關［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，轉基因黃瓜土壤和非轉基因黃瓜土壤中Proteobacteria為優(yōu)勢菌群。這與他人的研究結果基本一致［20-22］。另外，在本研究兩種土壤中，Bacteroidetes和Acidobacteria的比例也相對較高，也與他人研究結果基本符合［20-22］。此外，Chloroflexi的比例也較高。Janssen通過16S rRNA基因克隆技術發(fā)現(xiàn)Chloroflexi在土壤中數(shù)量豐富，由于該類細菌生長緩慢，很難用培養(yǎng)法分離獲得［23-24］。Chloroflexi是海綿中大量存在，與海綿形成共生體，對于海綿來說具有重要的生態(tài)功能［25］。在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，該類細菌的生態(tài)功能還有待深入研究。

總體來看，雙鏈RNA轉基因黃瓜并未對土壤細菌群落產生明顯影響，但后續(xù)的長期觀察以及對根際土壤真核生物群落的影響還需深入研究。

［1］Stotzky G.Persistence and biological activity in soil of insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis and of bacterial DNA bound on clays and humic acids.Journal of Environmental Quality，2000，29(3):691-705.

［2］Philip J.Dale B C，Eliana M G F.Potential for the environmental impact of transgenic crops.Nature Biotechnology，2002，20:567-574.

［3］Devare M H，Jones C M，Thies J E.Effect of Cry3Bb Transgenic Corn and Tefluthrin on the Soil Microbial Community.Journal of Environmental Quality，2004，33(3):837-843.

［4］Susanne B，Christoph C T.Field studies on the environmental fate of the Cry1Ab Bt-toxin produced by transgenic maize(MON810)and its effect on bacterial communities in the maize rhizosphere.Molecular Ecology，2005，14(8):2539-2551.

［5］Yang Y H.Advances on the effects of genetically modified crops on soil microbial community and main countermeasures of their approaches.Journal of Agricultural Biotechnology，2011，19(1):1-8.

［6］Chen G H，Xiao L，Zhang S Q，Xie B Y.Analysis of silencing MAPK by RNA interference of root-knot nematode:Acta Phytopathologica Sinica，2008，38(5):509-513.

［7］Lane，D.J.16S/23S rRNA sequencing.In:Nucleic acid techniques in bacterial systematics.Stackebrandt，E.，and Goodfellow，M.，eds.，John Wiley and Sons，New York，NY，1991，pp.115-175.

［8］Schloss P D，Handelsman J.Introducing DOTUR，a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness.Applied and Environmental Microbiology，2005，71(3):1501-1506.

［9］Rani A，Porwal S，Sharma R，Kapley A，Purohit HJ，Kalia V C.Assessing microbial diversity by culture-dependent and independent approaches for efficient functioning of effluent treatment plants.Bioresource Technology，2008，99:7098-7107.

［10］Yadav BC，Veluthambi K，Subramaniam K.Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection.Molecular＆ Biochemical Parasitology，2006，148:219-222.

［11］Lu X M，Zhu L Q，Cao Y P.Recent Advances of Bt Crops and Its Safety Assessment.Journal of Shanghai Jiaotong University(Agricultural Science)，2006，24(2):214-220.

［12］Means N E，Kremer R J，Ramsier C.Effects of glyphosate and foliar amendments on activity of microorganisms in the soybean rhizosphere.Journal of Environmental Science and Health，Part B:Pesticides，F(xiàn)ood Contaminants，and Agricultural Wastes，2007，42(2):125-132.

［13］Baumgarte S，Tebbe C C.Field studies on the environmental fate of the Cryl Ab Bt-toxin produced by transgenic maize(MON8 10)and its effect on bacterial communities in the maize rhizosphere.Molecular Ecology，2005，14(8):2539-2551.

［14］Shen R F，Cai H，Gong W H.Transgenic Bt cotton has no apparent effect on enzymatic activities or functional diversity of microbial communities inrhizosphere soil.Plant and Soil，2006，285(1/2):149-159.

［15］Urwin P E，Catherine J L，Howard J A.Ingestion of Double-Stranded RNA by Preparasitic Juvenile Cyst Nematodes Leads to RNA Interference.Molecular Plant-Microbe Interactions，2002，15(8):747-752.

［16］Phillip D Z，Thomas T，Phillip A S，David P B.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals.Cell，2000，101:25-33.

［17］Tom A M，R.Elizabeth S，Penny R H.The detection of Gram-negative bacterial mRNA from soil by RT-PCR.FEMS Microbiology Letters，1998，164(2):369-373.

［18］Hu Y S，Liy Y F，Wu K，Dou H J，Jia X C.Variation of Microbial Community Structure in Relation to Successive Cucumber Cropping Soil.Chinese Journal of Soil Science，2006，37(1):126-129.

［19］Hu Y S，Wu K，Li C X，Jia XC.Effect of Continuous Cropping of Cucumber on Soil Microbial Population Ⅱ — Variation Analysis Based on DGGE Approach.Scientia Agricultura Sinica，2007，40(10):2267-2273.

［20］Liu W Q，Mao Z C，Yang Y H，Xie B Y.Microbial Community Structure in Greenhouse Field Soil Infested with Root-Knot Nematodes.Chinese Journal of Biological Control，2008，24(4):318-324.

［21］Liu W Q，Mao Z C，Yang Y H，Xie B Y.Analysis of soil bacterial diversity by Using the 16S rRNA gene Library.Acta Microbiologica Sinica，2008，48(10):1344-1350.

［22］Schloss PD，Handelsman J.Status of the microbial census.Microbiology and molecular biology Review，2004，68(4):686-691.

［23］Janssen P H.Identifying the dominant soil bacterial taxa in libraries of 16S rRNA and 16S rRNA genes.Applied and Environmental Microbiology，2006，72:1719-1728.

［24］Kathryn E R，Davis，P S，Peter H J.Acidobacteria，Rubrobacteridae and Chloroflexi are abundant among very slow-growing and mini-colonyforming soil bacteria.Environmental Microbiology，2011，13(3)，798-805.

［25］Susanne S，Peter D，F(xiàn)aris B，Michael W，Michael W T.Chloroflexi bacteria are more diverse，abundant，and similar in high than in low microbial abundance sponges.FEMS Microbiol Ecol，2011，78:497-510.

參考文獻:

［5］楊永華.轉基因作物對土壤微生物群落的影響及主要研究策略.農業(yè)生物技術學報，2011，l9(l):1-8.

［6］陳國華，肖羅，張雙慶，等.南方根結線蟲促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因的RNAi效應分析.植物病理學報，2008，38(5):509-513.

［11］陸小毛，朱路青，曹越平.轉Bl基因作物及其安全性研究.上海交通大學學報(農業(yè)科學版)，2006，24(2):214-220.

［18］胡元森，劉亞峰，吳坤，竇會娟，賈新成.黃瓜連作土壤微生物區(qū)系變化研究.土壤通報，2006，37(1):126-129.

［19］胡元森，吳坤，李翠香，賈新成.黃瓜連作對土壤微生物區(qū)系影響 Ⅱ——基于DGGE方法對微生物種群的變化分析.中國農業(yè)科學，2007，40(10):2267-2273.

［20］劉瑋琦，茹振川，楊宇紅，謝丙炎.保護地根結線蟲發(fā)生地土壤微生物群落多樣性的研究.中國生物防治，2008，24(4):318-324.

［21］劉瑋琦，茆振川，楊宇紅，謝丙炎.應用16S rRNA基因文庫技術分析土壤細菌群落的多樣性.微生物學報，2008，48(10):1344-1350.