白薇揚，趙清華，譚懷琴

(1.重慶理工大學 化學化工學院，重慶 400054;2.西南大學資源與環(huán)境學院，重慶 400715)

植物修復(fù)是利用可超富集重金屬的植物吸收、積累環(huán)境中的污染物，并降低其毒害的環(huán)保生物技術(shù)［1－2］。早期植物提取技術(shù)研究主要集中在超富集植物方面，但超富集植物通常只能富集某種特定重金屬，且生長速度慢，生物量低，這些不足限制了它在植物修復(fù)技術(shù)中的實際應(yīng)用［3］。高生物量作物對重金屬累積含量一般不高，但由于其生物量大，具有較高的重金屬累積量，因而利用高生物量作物修復(fù)土壤已引起廣泛的關(guān)注。

EDTA是螯合誘導(dǎo)植物修復(fù)土壤中最常用，也是研究最多的一種螯合劑，能大幅度增加植物對重金屬的吸收和富集，提高植物修復(fù)效率［4－5］。但EDTA在環(huán)境中很難降解，殘留時間較長，容易導(dǎo)致處理場所的重金屬向周圍和地下水遷移，造成二次污染。生物螯合劑EDDS與過渡金屬具有螯合作用，能被生物降解，其生物毒性(包括對植物和土壤微生物的毒性)均低于EDTA，但是其對重金屬Pb和Cd的螯合能力不如EDTA［6］。

一般而言，對于螯合誘導(dǎo)植物修復(fù)的研究基本集中在某一種螯合劑對重金屬土壤污染的治理上，而對于可生物降解螯合劑EDDS和非可生物降解螯合劑EDTA的聯(lián)合使用尚未見報道。本文在高生物量作物玉米和油菜上施用不同配比EDTA與EDDS，在獲得最小環(huán)境風險的同時最大程度地提高螯合誘導(dǎo)效率，獲得螯合誘導(dǎo)EDTAEDDS技術(shù)最佳施用配比量準則，以期對實際工程應(yīng)用提供理論和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試植物為單子葉植物玉米(zea mays L)、雙子葉植物油菜(brassica junica)。實驗土壤為重慶理工大學旁菜地表層0～30 cm的土壤，經(jīng)自然風干后研磨，過4 mm篩備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 土壤培養(yǎng)

實驗采用Cu、Pb、Cd三種重金屬污染的土壤。每盆裝3 kg土壤，分別設(shè)置添加CuSO4.5(H2O)700 mg· kg－1、CdCl2· H2O 25 mg· kg－1、Pb(N03)22600 mg·kg－1，共計20盆。重金屬污染土壤反復(fù)混勻后靜置平衡15 d后播種。

1.2.2 盆栽培養(yǎng)

盆栽試驗在室內(nèi)進行。每盆裝3 kg經(jīng)重金屬平衡后的土壤，播撒20顆種子于盆中。待種子出苗3周后，每盆保留長勢良好、生長高度約10 cm的幼苗5株。植物生長期間定期稱重，定量補充水分100～200 mL，保證植物生長。同時室溫控制在20～25℃，濕度控制在50% ～70%。出苗6周后，按如下處理方式分別添加EDTA和EDDS:①對照組(CK):加去離子水;② EDTA:施入3 mmol·kg－1EDTA;③ 配比 1(EDTA/EDDS=1∶1):施入 0.5 mmol·kg－1(EDTA)+0.5 mmol·kg－1(EDDS);④ 配比 2(EDTA/EDDS=2∶1):施入1 mmol· kg－1(EDTA)+0.5mmol· kg－1(EDDS);⑤ 配比3(EDTA/EDDS=1∶2):施入0.5 mmol· kg－1(EDTA)+ 1 mmol· kg－1(EDDS);⑥ EDDS:施入 3 mmol·kg－1(EDDS)。

盆栽植物在添加EDTA和EDDS 2周后進行收割處理。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測定

測得的土壤理化性質(zhì)見表1。

1.3.2 植物及土壤樣品中重金屬含量測定

采集完整植株樣品以及根際土壤。土壤為表層以下20 cm的土壤。

植株經(jīng)自來水和超純水清洗，80℃烘箱烘干，研碎過100目篩，待測。土壤樣品采用四分法取盆中樣品，自然風干后研磨過200目篩，待測。

植物樣品的消解采用 Durali Mendil等方法［5］，即在 Teflon消化罐中加入 0.5 g植物樣品，依次加入6 mL硝酸(65%)和2 mL雙氧水(30%)，在微波爐中加壓加熱消解。消解完全后定容至25 mL。

表1 土壤的理化性質(zhì)

土壤樣品的消解采用Maiz等提出的連續(xù)提取方法［6］。將重金屬 Pb、Cd、Zn的化學形態(tài)區(qū)分為活動態(tài)、可交換態(tài)和強結(jié)合態(tài)(殘留態(tài))。具體操作步驟如下:

1)活動態(tài):稱取3.0 g土壤樣品置于50 mL離心管中，加入 30 mL 0.01 mol·L－1的 CaCl2溶液，室溫震蕩2 h，在離心機上離心10 min(3 000 r·min－1)，過濾上清液。殘渣中加入5 mL去離子水，離心，棄去上清液，重復(fù)2次。

2)可交換態(tài)(絡(luò)合態(tài)、吸附態(tài)、碳酸鹽態(tài)和部分有機態(tài)):上步殘留土樣加入CaCl2和TEA(三乙醇胺)的混合溶液和6 mL DTPA，室溫震蕩4 h。所需混合溶液配制方案(按10 L計算):29.84 g TEA+3.93 g DTPA+2.94 g CaCl2·2H2O，溶于200 mL去離子水中，稀釋至9 L，然后用1∶1的HCl調(diào)節(jié) pH 值至 7.3 ±0.05，最后定容至 10 L。混合溶液的最終摩爾體積分數(shù)為0.005 mol·L－1DTPA、0.1 mol·L－1TEA、0.01 mol·L－1CaCl2。在離心機上離心10 min(3 000 r/min)，過濾上清液。殘渣中加入5 mL去離子水，離心，棄去上清液，重復(fù)2次。

3)強結(jié)合態(tài)(殘渣態(tài)):上步殘留土樣轉(zhuǎn)入Teflon消解罐中，加入2 mL濃 HNO3(65%)和2 mL HF(40%)，200℃恒溫加熱消解8 h。

使用原子吸收分光光度計(島津AA6800)測定其土壤和植物樣品消解液中重金屬Cu、Pb、Cd、Cr含量。

整個測定過程中土壤樣用NIST 2710#標準物質(zhì)，植物樣用灌木枝葉GBW07602作質(zhì)量控制參考物質(zhì)。

測試過程中每批樣品分析均作2個全程序空白，借以檢查和控制樣品在處理和測試過程中可能帶來的污染。采用平行樣控制樣品測試的精密度，平行樣品數(shù)不少于測試樣品的10%。同時對每批樣品進行加標回收，回收率為86% ～105%。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Origin8.0繪圖，用 SPSS13.0進行顯著性檢驗及相關(guān)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 EDTA/EDDS配比對土壤有效態(tài)重金屬含量影響

土壤有效態(tài)重金屬是植物能吸收利用的土壤中活動態(tài)和可交換態(tài)重金屬［7］。相比對照組，玉米組添加螯合劑的土壤有效態(tài)重金屬含量顯著增高(表2)。土壤有效態(tài)重金屬Pb含量在添加配比2 的螯合劑時達到最高，為 109.6 mg·kg－1，為對照組的11倍。土壤有效態(tài)重金屬Pb含量順序依次為:配比2＞配比3＞EDTA＞EDDS＞配比1。土壤有效態(tài)重金屬Cu在添加配比2的螯合劑時含量最高，達到1 369 mg·kg－1。土壤有效態(tài)重金屬Cu含量順序依次為:配比2＞EDDS＞配比1＞EDTA＞配比3。土壤有效態(tài)重金屬Cd含量在添加配比1的螯合劑時達到最高，為59.4 mg·kg－1，是對照組土壤有效態(tài)重金屬 Cd的5.5倍。植物對離子的吸收主要取決于溶液中該離子游離態(tài)的活度大小。然而，許多土壤中大部分金屬在固相上，并且經(jīng)常被非常牢固地結(jié)合。許多高產(chǎn)作物不像超富集植物那樣具有自然富集金屬的特征，不具有吸收大量金屬的特性，所以需要向土壤中加螯合劑以增加土壤溶液中金屬的濃度，促進植物對金屬的吸收和富集［7］。對于如Pb、Cu等不溶性或難溶性金屬，需要在植物生長介質(zhì)中加入化學螯合物質(zhì)來溶解釋放不溶性的靶金屬［8］。螯合劑對金屬離子的螯合，在降低溶液中游離態(tài)金屬離子活度的同時，也使土壤重金屬從難溶性的形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘男螒B(tài)，增加了土壤溶液中的金屬濃度［6－8］。

與對照組相比，添加螯合劑的油菜組土壤有效態(tài)重金屬含量具有不同程度增加(表3)。土壤有效態(tài)重金屬Pb在添加配比2的螯合劑時含量是對照組的 5.2 倍，達到 300.5 mg·kg－1。土壤有效態(tài)重金屬Cu含量在添加配比2的螯合劑時達到最高，為913 mg·kg－1。當添加配比3螯合劑時，土壤有效態(tài)重金屬 Cd含量達到最高，為89.6 mg·kg－1，是對照組土壤有效態(tài)重金屬鎘的12.3倍。研究表明:投加EDTA和乙酸，與只使用EDTA比較，使印度芥菜對鉛的積累量增倍，復(fù)合投加螯合劑表面活性劑相比單獨投加時效果好［9］。Luo等［10］發(fā)現(xiàn)組合使用 EDTA 和 EDDS，會提高植物提取銅、鉛、鋅、鎘的效率，與單獨使用EDTA或EDDS時相比能達到一個更高的水平。Tandy等［11］認為出現(xiàn)這樣結(jié)果是由于 EDTA和EDDS在植物提取金屬的效率上存在差異，加入EDDS，使得EDTA捕獲痕量金屬的有競爭力的陽離子減少，如土壤可溶性鈣Ca。但由于螯合劑表面活性劑與重金屬形成水溶性膠體，增加了重金屬在土壤中的可移動性，因此存在污染地下水的潛在風險。

表2 玉米植物內(nèi)Pb、Cu、Cd的含量及其根部土壤中Pb、Cu、Cd的化學形態(tài) mg·kg－1

表3 油菜植物內(nèi)Pb、Cu、Cd的含量及其根部土壤中Pb、Cu、Cd的化學形態(tài) mg·kg－1

2.2 EDTA/EDDS配比對植物重金屬含量分布特征影響

添加不同配比EDTA/EDDS對植物地下部分重金屬Pb、Cu、Cd累積量均有所增加(圖1)。對于Pb而言，添加配比3的螯合劑時，對油菜地下部分重金屬Pb累積量促進作用最為明顯，達到5 473 mg·kg－1。玉米地下部分重金屬Pb累積量在添加配比2的螯合劑時，促進作用最明顯，達到4 201 mg·kg－1。對Cu而言，添加配比3的螯合劑時，對玉米和油菜地下部分重金屬Cu累積量促進作用均最明顯，玉米和油菜地下部分Cu累積量分別達到4 095、5 475 mg·kg－1。對 Cd 而言，當添加配比 3的螯合劑時，對玉米和油菜地下部分重金屬Cd累積量促進作用均最明顯，玉米和油菜地下部分Cd累積量分別達到48.93、103.38 mg·kg－1。

圖1 EDTA/EDDS配比對玉米、油菜地下部分重金屬 Pb、Cu、Cd 影響

添加不同配比EDTA/EDDS對植物地上部分重金屬Pb、Cu、Cd累積量均有較大程度增加(圖2)。對于Pb而言，添加配比3的螯合劑時，對玉米和油菜地上部分重金屬Pb累積量促進作用均最為明顯，達到632和793.6 mg·kg－1。對于 Cu而言，添加單一螯合劑EDDS時，對玉米地上部分重金屬Cu累積量促進作用最明顯，玉米地上部分Cu累積量達到1149 mg·kg－1。添加配比3的螯合劑時，對油菜地上部分重金屬Cu累積量促進作用最明顯，Cu累積量達到3874 mg·kg－1，是對照組Cu累積量的21倍。對Cd而言，當添加配比3的螯合劑時，對玉米和油菜地上部分重金屬Cd累積量促進作用均最明顯，玉米地上部分Cd累積量達到11.4 mg·kg－1，油菜地上部分累積量達到20.64 mg· kg－1。

圖2 EDTA/EDDS配比對玉米、油菜地上部分重金屬 Pb、Cu、Cd 影響

EDTA EDDS是羥基羧酸螯合劑，具有多齒狀的配位基，能與重金屬形成具有螯環(huán)的螯合物［12］。當EDTA-EDDS進入土壤后，與金屬離子螯合形成金屬－配位復(fù)合體，由于離子價數(shù)的減少或電性的變化，土壤對金屬－配位復(fù)合體的吸持強度大大降低，為了維持固液相之間的平衡關(guān)系，金屬從土壤顆粒表面解吸，從而增加了重金屬的有效性［13］。

2.3 EDTA/EDDS配比對植物重金屬遷移能力影響

S/R比值是植物地上部分重金屬含量與根部重金屬含量的比值，反映了重金屬由植物根部吸收進入植物體內(nèi)的遷移程度［14］。該值越大，說明植物對重金屬的運輸能力越強。螯合劑能增加土壤中重金屬的溶解度，促進重金屬自根系向地上部轉(zhuǎn)運，當部分金屬離子穿過細胞壁和細胞膜進入細胞后，能和細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)等形成復(fù)雜的穩(wěn)定螯合物［14］。

從圖3可以看出:加入螯合劑的植物S/R值均高于相應(yīng)對照組植物S/R值。對于玉米而言，當添加單一螯合劑EDTA時，其地下部分含量重金屬Pb輸移系數(shù)S/R比值達到最高為0.19。當添加配比2的螯合劑時，其地下部分含量重金屬Cu輸移系數(shù)S/R比值達最高為0.39。當添加配比1的螯合劑時，其地下部分含量重金屬Cd輸移系數(shù)S/R比值最高為0.72。對于作物油菜而言，當添加螯合劑為配比3時，其地下部分含量重金屬Pb和Cu輸移系數(shù)S/R比值均達到最高，為0.34和0.7。當添加單一螯合劑EDTA時，其地下部分含量重金屬Cd輸移系數(shù)S/R比值最高為0.34。

根據(jù) Reeve的觀點［14］，S/R 的臨界值為 0.5。如果植物的S/R值超過0.5，則說明該植物具備了修復(fù)土壤重金屬污染的能力［8］。對于Cu而言，添加螯合劑為配比3時，植物體內(nèi)重金屬Cu的S/R系數(shù)達0.71。對于Cd而言，添加螯合劑為配比1時，植物體內(nèi)重金屬Cd的S/R系數(shù)達到0.6。本次添加不同螯合劑配比試驗結(jié)果顯示:螯合劑與重金屬形成的螯合物可以直接進入植物體內(nèi)，并有利于重金屬從根部轉(zhuǎn)運到地上部，從而大大增加了高生物產(chǎn)量作物對重金屬的輸移能力。

3 討論

土壤作用過程是指螯合劑進入土壤后，將重金屬從土壤顆粒上解吸到土壤溶液中，而土壤溶液是土壤中礦質(zhì)離子、重金屬離子以及植物根系直接作用的介質(zhì)，因而大大增加了植物對重金屬吸收的可能性。植物作用過程包括了植物根系對土壤溶液中重金屬的吸收以及重金屬在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和貯存。本研究通過添加不同配比的非生物螯合劑－生物螯合劑均不同程度增加了土壤有效態(tài)重金屬的含量，促進了玉米和油菜對重金屬pb、Cu、Cd的吸收。土壤有效態(tài)金屬Pb、Cu含量，在添加螯合劑為配比2時均達到最高，分別為386.5和1369 mg·kg－1。屬同分異構(gòu)體的 EDTA和EDDS，當配位體過量時，EDTA的絡(luò)合能力大于EDDS，而當過量的配位體減少時，EDDS對Cu的絡(luò)合能力大于 EDTA。Tandy［11］研究表明:EDTA對Pb的螯合常數(shù) logKs為17.88，而 EDDS的螯合常數(shù)logKs為12.7。

圖3 EDTA/EDDS配比對不同植物重金屬遷移能力S/R影響

魏嵐［13］在研究中發(fā)現(xiàn):EDDS處理下對茼蒿Cu含量和累積量促進作用最大，茼蒿地上部Cu含量和累積量分別達到973 mg kg－1。土壤有效態(tài)金屬Cd在添加螯合劑為配比3時達到最高，為89.6 mg·kg－1。植物地下部分和地上部分 Pb、Cu、Cd生物累積量在添加螯合劑為配比3時達到最高。EDTA與EDDS的聯(lián)合施用有效降低了單一螯合劑的施用量，能減少螯合劑對植物的毒害作用，避免植物生物量的減少。

重金屬超富集植物僅有400多種，不足被子植物的0.2%，而且大部分超富集植物生物量小、生長緩慢，無法滿足重金屬污染土壤修復(fù)的需求。因此，需要培育生物量高、生長迅速、易于田間管理且對重金屬有較高耐性的作物。但是這類植物對重金屬的富集潛力十分有限，需要采用化學強化措施來提高提取修復(fù)潛力。本研究通過生物螯合劑EDDS與非生物螯合劑EDTA的聯(lián)合使用，大大增加了高生物產(chǎn)量作物對重金屬的輸移能力，對于重金屬Cu，S/R系數(shù)可以達到0.71，而對于Cd，S/R系數(shù)可以達到0.6，滿足了植物修復(fù)重金屬條件。

此外，高劑量人工合成劑會對植物產(chǎn)生毒害作用。添加單一螯合劑 EDTA為3 mmol·kg－1組，玉米和油菜表現(xiàn)尤為明顯，植物出現(xiàn)發(fā)蔫、變黃現(xiàn)象，說明螯合劑的加入會影響到植物的正常生長［15－17］。金屬跨根細胞膜進入根細胞共質(zhì)體或木質(zhì)部薄壁細胞的質(zhì)膜裝載進入木質(zhì)部導(dǎo)管時，由專一性運輸?shù)鞍谆蛲ǖ赖鞍渍{(diào)控。重金屬一旦進入根細胞，可蓄積在根部或運輸?shù)降厣喜浚?8］。由于內(nèi)皮層上有凱氏帶，離子轉(zhuǎn)入共質(zhì)體后進入木質(zhì)部導(dǎo)管，再進入根細胞質(zhì)，導(dǎo)致游離離子過多，對細胞產(chǎn)生毒害，因而重金屬可能與細胞質(zhì)中的有機酸、氨基酸、多肽和無機鹽結(jié)合，通過液泡膜上的運輸體或通道蛋白運入液泡中。植物從根部吸收重金屬并將其轉(zhuǎn)移和積累到地上部。這個過程包括很多環(huán)節(jié)和調(diào)控位點［18］。總體來看，投加螯合劑雖然對植物和土壤特性有一定的影響，但有利于加速植物對土壤的修復(fù)，建議分次投加螯合劑以減弱其帶給植物和環(huán)境的不利影響。

［1］溫麗，傅大放.兩種強化措施輔助黑麥草修復(fù)重金屬污染土壤［J］.中國環(huán)境科學，2008，28(9):786 －79.

［2］Arwidsson Z，Johansson E，van Kronhelm T，et al.Remediation of metal conminated soil by organic metabolites from fungi I:Production of organicacids［J］.Water，Air arm Soil Pollution，2010(205):215 －226.

［3］Hauser L，Tandy S，Schulin R，et al.Column extraction of heavy metals from soils using the biodegradable chelating agent EDDS［J］.Environmental Science＆Technology，2005，39(17):6819 －6824.

［4］Ultra V U，Yano A，1wasaki K，et al.Influence of chelating agent addition on copper distribution and microbial activity in soil and copper uptake by brown mustard(Brassica juncea)［J］.Soil Science and Plant Nutrition，2005，51(2):193 －202.

［5］Durali Mendil.Determination of trace elements on some wild edible mushroom samples from Kastamonu，Turkey［J］.Food Chemistry，2004，88(2):281 －285.

［6］Maiz I.Evaluation of heavy metal availability in contaminated soils by a short sequential extraction procedure［J］.Science of The Total Environment，1997，206(2):107－115.

［7］Chen Y X，Wang Y P，Wu W X，et al.Impacts of chelateassisted phytoremediation on microbial community composition in the rhizosphere of a copper accumulator and non-accumulator［J］.Science of the Total Environment，2006，356:247 －255.

［8］Ma L Q，Komar K M，Tu C，et al.A fern that hyperaccumulates arsenic［J］.Nature，2001，409:579 －579.

［9］Chiu K K，Ye Z H，Wong M H.Enhanced uptake of As，Zn，and Cu by Vetiveria zizanioides and Zea mays using chelating agents［J］.Chemosphere，2005，60:1365－1375.

［10］Luo C L，Shen Z，Lou L Q，et al.EDDS and EDTA enhanced phytOextractiOn of metals from artificially contaminated soil and residual effects of chelant compounds［J］.Environmental Pollution，2006，144(3):862 －871.

［11］Tandy S，Bossart K，Mueller R，et al.Extraction of heavy metals from soils using biodegradable chelating agents［J］.Environmental Science and Technology，2004，38(3):937－944.

［12］Wu L H，Luo Y M，Xing X R，et al.EDTA-enhanced phytommediation of heavy metal contaminated soil with Indian mustard and associated potential leaching risk［J］.Agriculture Ecosystems ＆ Environment，2004，102:307 －318.

［13］魏嵐，陳亞華，錢猛，等.可降解螫合劑EDDS誘導(dǎo)植物修復(fù)重金屬污染土壤的潛力［J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2006，29(2):33 －38.

［14］Reeves R D.The hyperaccumulation of nickel by serpentine plants［C］//Gunn J M.Baker vegetation of ultramatic(sperntine)soil.Andover，Hampshire，U K:Intercept Ltd，1992:253 －277.

［15］伍鈞，孟曉霞，李昆.鉛污染土壤的植物修復(fù)研究進展［J］.土壤，2005，37(3):258 －264.

［16］孫小峰，吳龍華，駱永明.EDDS對海州香薷修復(fù)重金屬復(fù)合污染土壤的田間效應(yīng)［J］.土壤，2006，38(5):609－613.

［17］胡亞虎，魏樹和，周啟星，等.螯合劑在重金屬污染土壤植物修復(fù)中的應(yīng)用研究進展［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2010，29(11):2055 －2063.

［18］劉素純，蕭浪濤，王惠群，等.植物對重金屬的吸收機制與植物修復(fù)技術(shù)［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版，2004，30(5):493 －498.