謝愛蓉，呂建新

（溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

結(jié)核病對醫(yī)務(wù)人員的職業(yè)危害不可忽視，實驗室工作人員結(jié)核患病風(fēng)險為普通人群的7～79倍[1]?？顾釛U菌涂片鏡檢作為發(fā)現(xiàn)傳染源、選擇化療方案、考核評價療效的重要手段，在現(xiàn)代結(jié)核病控制工作中占有不可或缺的位置。所以在不影響涂片染色鏡檢的情況下，將涂片中的分枝桿菌滅活，對于提高基層實驗室生物安全有重要意義。本實驗利用紫外線照射、次氯酸鈉溶液消毒及高壓蒸汽滅菌三種方法對痰涂片進(jìn)行前處理，用以滅活分枝桿菌，觀察其效果。

1 材料和方法

1.1 材料 73份新鮮抗酸染色陽性痰液由溫州市鹿城區(qū)人民醫(yī)院痰檢實驗室提供。次氯酸鈉消毒液、抗酸染色液分別購自杭州西子衛(wèi)生消毒藥械有限公司、杭州嘉偉生物制品有限公司。改良羅氏培養(yǎng)基按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[2]自制。

1.2 方法

1.2.1 痰液處理及分組：痰液充分震蕩勻化，確保細(xì)菌的均勻分布，然后分為四份，分別用于對照組、紫外線照射組、次氯酸鈉溶液消毒組及高壓蒸汽滅菌組。

1.2.2 各組處理：

1.2.2.1 對照組：采用直接涂片方式，取40μL痰液在涂片中央處均勻涂抹成10 mm×20 mm的橢圓形痰膜，制作兩張涂片：一張進(jìn)行抗酸染色，作為鏡檢對照；一張經(jīng)火焰固定后刮取痰膜，放入含1 mL 0.9%氯化鈉溶液的試管中浸泡，并加入等體積4% H2SO4，強烈振蕩，靜置20 min后培養(yǎng)。剩余痰液采用分枝桿菌分離培養(yǎng)酸處理方法[2]消化去污，作為培養(yǎng)對照。

1.2.2.2 紫外線照射組：將涂片置于LABCONCO B2生物安全柜內(nèi)，用輻照度值為332～360μw/cm2的紫外燈分別垂直照射（距離58 cm）10、20、40、60、80 min后，同火焰固定培養(yǎng)操作處理，刮取痰膜培養(yǎng)。

1.2.2.3 次氯酸鈉溶液消毒組：將痰液分為兩小組，向痰液中加入等量有效氯濃度50 g/L次氯酸鈉溶液處理10～15 min后，一組加入等量的蒸餾水混勻，以2500 r/min速度離心15 min，取沉淀；一組加蒸餾水至15 mL混勻，室溫中靜置過夜（15～18 h），取沉淀。

1.2.2.4 高壓蒸汽滅菌組：將痰液放入高壓蒸汽滅菌鍋中（壓力103.4 kPa，溫度121 ℃），滅菌20 min。以2500 r/min速度離心15 min，取沉淀。

1.2.3 抗酸染色鏡檢：將處理后的各組痰液，采用對照組涂片方式制作涂片，然后進(jìn)行萋-尼氏抗酸染色及鏡檢分級報告[2]。

1.2.4 分枝桿菌培養(yǎng)與報告：將處理后的各組痰液，取100μL無菌接種于改良L-J培養(yǎng)基，37 ℃溫箱培養(yǎng)，參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[2]方法觀察并報告結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 使用SPSSl6.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用Friedman M檢驗各組萋-尼染色鏡檢結(jié)果分級差異，然后用Wilcoxon符號秩和檢驗進(jìn)行兩兩比較；logistic回歸分析殺菌效果與痰液含菌量、紫外線照射時間之間的關(guān)系，用x2線性趨勢檢驗菌量與殺菌效果間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗酸染色鏡檢比較 各組鏡檢結(jié)果分級存在差異（P＜0.05）。73份痰液，對照組結(jié)果為抗酸桿菌陽性（1～8條/300視野）8份，抗酸桿菌陽性（1+）6份，抗酸桿菌陽性（2+）18份，抗酸桿菌陽性（3+）11份，抗酸桿菌陽性（4+）30份。經(jīng)紫外線照射后，鏡檢結(jié)果分級及涂片上結(jié)核菌的染色性、形態(tài)均未發(fā)生改變，與對照組相同。次氯酸鈉溶液消毒組（沉淀法、離心法）鏡檢結(jié)果低于對照組（P＜0.05），見表1-2。次氯酸鈉溶液消毒組中沉淀法與離心法鏡檢結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。高壓蒸汽滅菌組鏡檢結(jié)果分級高于對照組（P＜0.05），見表4，但其中一張涂片因痰膜脫落，無法鏡檢。在抗酸染色鏡檢效果上，次氯酸鈉溶液消毒組及高壓蒸汽滅菌組鏡下沒有黏液及細(xì)胞的干擾，背景較單一、干凈。

2.2 分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果 培養(yǎng)對照結(jié)果為涂陽培陽65份，涂陽培陰5份，污染3份。各組分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果比較采用培養(yǎng)對照涂陽培陽的65份樣本?；鹧婀潭ê笈囵B(yǎng)結(jié)果與培養(yǎng)對照相同。紫外照射組，隨著紫外線照射時間的延長，培養(yǎng)陰性涂片數(shù)逐漸增多，當(dāng)輻照60 min后，所有涂片分枝桿菌培養(yǎng)均為陰性。經(jīng)logistic檢驗，分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果與涂片含菌量、紫外線照射時間有顯著相關(guān)性，P＜0.05，見表5。要達(dá)到殺滅分枝桿菌的目的，菌量越多，培養(yǎng)陰性所需照射時間越長。輻照強度、照射時間相同的情況下，菌量與培養(yǎng)陽性比例存在線性趨勢，P＜0.05，見表6，說明菌量越多，培養(yǎng)陽性比例越大，即殺菌效果越差。次氯酸鈉溶液消毒組分枝桿菌培養(yǎng)均為陰性。

表1 次氯酸鈉溶液沉淀法與對照組抗酸染色鏡檢結(jié)果分級比較

表2 次氯酸鈉溶液離心法與對照組抗酸染色鏡檢結(jié)果分級比較

表3 次氯酸鈉溶液沉淀法與離心法抗酸染色鏡檢結(jié)果分級比較

表4 高壓蒸汽滅菌組與對照組抗酸染色鏡檢結(jié)果分級比較

表5 不同菌量的涂片經(jīng)紫外線照射不同時間的培養(yǎng)結(jié)果

表6 不同菌量的涂片照射相同的時間（10 min）后的培養(yǎng)結(jié)果

3 討論

本實驗中火焰固定后的涂片培養(yǎng)均為陽性，說明火焰固定并不能殺死涂片上的分枝桿菌。所以涂片在未染色前，應(yīng)進(jìn)行滅活處理，以減少實驗室生物安全危險因素。本實驗采用紫外線照射消毒、次氯酸鈉溶液消毒及高壓蒸汽滅菌三種方法對痰涂片進(jìn)行前處理，用以滅活涂片中的分枝桿菌。

結(jié)果顯示紫外線照射不影響涂片抗酸染色鏡檢，當(dāng)紫外線輻照劑量達(dá)到1195200～1296000 μw·s/cm2時，培養(yǎng)均為陰性。紫外線照射法其優(yōu)點在于：完好保持了分枝桿菌的抗酸染色特性，而且它不僅殺滅痰膜上的分枝桿菌，也殺滅了制片過程中產(chǎn)生的氣溶膠中的分枝桿菌；該法無需特殊的儀器設(shè)備，也不需要配制試劑，安全、簡便。但是由于紫外線的穿透能力較弱，且其殺菌效果與其輻照強度、照射時間及照射距離密切相關(guān)，并受環(huán)境相對濕度影響[3]，所以利用生物安全柜中紫外燈照射消毒涂片，涂片應(yīng)均勻涂抹、厚度適宜，不宜過厚，輻照劑量要至少達(dá)到1195200μw·s/cm2。使用中的紫外線燈管應(yīng)定期擦拭清潔，并對其輻照強度進(jìn)行監(jiān)測，及時更換燈管，以達(dá)到有效消毒目的。

本實驗證明有效氯含量為50 g/L的次氯酸鈉溶液，處理痰液10～15 min，可有效殺滅痰液中的分枝桿菌。次氯酸鈉溶液沉淀法與離心法其抗酸染色鏡檢結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與Rasheed等[4]報道相同。但與對照組相比，次氯酸鈉溶液消毒組鏡檢結(jié)果分級降低，并出現(xiàn)高假陰性，與相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]報道一致。次氯酸鈉溶液消毒法其優(yōu)點在于：方法簡便，試劑便宜，且易取得；由于次氯酸鈉消化了痰液中的黏液及細(xì)胞，使得顯微鏡下視野背景單一，更加清晰，提高了閱片的速度；相關(guān)文獻(xiàn)[6]報道次氯酸鈉消毒法敏感性較直接涂片法提高。缺點在于：次氯酸鈉溶液不穩(wěn)定，在使用過程中要注意低溫、避光保存；處理痰液的時間要把握準(zhǔn)確，據(jù)報道稱次氯酸鈉接觸時間過長，會對分枝桿菌造成損傷，當(dāng)時間＞60 min時，則可能導(dǎo)致抗酸桿菌的檢出率逐漸降低[5]；次氯酸鈉溶液消毒法特異性較傳統(tǒng)直接涂片法有所降低[6]。

高壓蒸汽滅菌法其涂片鏡檢，鏡下背景干凈、清晰，經(jīng)離心其鏡檢結(jié)果分級高于對照組（P＜0.05）。相關(guān)文獻(xiàn)[7]亦報道高壓滅菌后離心痰液，所制成的痰涂片，抗酸桿菌檢出率有效提高。但是本研究發(fā)現(xiàn)，痰液經(jīng)高壓滅菌后，由于痰液中的蛋白質(zhì)變性，痰膜較脆弱，在染色過程中易脫落，實驗中有1份樣本由于涂片痰膜徹底脫落，而致無法進(jìn)行隨后的鏡檢工作。高壓滅菌法優(yōu)點在于集菌效果顯著，且消毒徹底，殺滅了一切微生物，大大提高了實驗室生物安全。但是對盛裝痰液的容器有要求，必須為耐高溫、高壓材料；而且實驗室必須配備高壓蒸汽滅菌鍋及適合的離心機；染色時需謹(jǐn)防痰膜脫落。由于處理痰液標(biāo)本需要3 h左右，故此法僅適用于批量處理樣本。

[1] Joshi R, Reingold AL, Menzies D, et al. Tuberculosis among health-care workers in low- and middle-income countries: a systematic review[J]. PLoS Med, 2006, 3(12): e494.

[2] 中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會. 結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程[M]. 北京: 中國教育文化出版社, 2006: 13-37.

[3] 楊華明, 易濱. 現(xiàn)代醫(yī)院消毒學(xué)[M]. 北京: 人民軍醫(yī)出版社,2002: 55-60.

[4] Rasheed MU, Dechu T. An overnight sedimentation method:improving the diagnosis of tuberculosis when electrical centrifuge is not available[J]. Trop Doct, 2008, 38(2): 78-79.

[5] Bonnet M, Ramsay A, Githui W, et al. Bleach sedimentation:an opportunity to optimize smear microscopy for tuberculosis diagnosis in settings of high prevalence of HIV[J]. Clin Infect Dis, 2008, 46(11): 1710-1716.

[6] Cattamanchi A, Davis JL, Pai M, et al. Does bleach-processing increase the accuracy of sputum smear microscopy for diagnosing pulmonary tuberculosis?[J]. J Clin Microbiol,2010, 48(7): 2433-2439.

[7] 王進(jìn)鴻, 宋現(xiàn)讓, 周蓮風(fēng), 等. 離心沉淀集菌涂片法檢查痰內(nèi)結(jié)核分枝桿菌[J]. 上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志, 2002, 17(3): 149-150.