羅萍，師莉莎，劉華忠

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)生物化學(xué)中心，廣東 湛江 524088）

我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥對(duì)烏賊墨悠遠(yuǎn)的醫(yī)用史實(shí)要追溯到《神農(nóng)本草經(jīng)》，“可收斂止血，固精止帶，制酸定痛，除濕斂瘡”?！侗静菔斑z》描述烏賊“腹中墨，主治血刺心痛”?，F(xiàn)代大量的研究結(jié)果證實(shí)，烏賊墨是一種多功能海洋活性物質(zhì)，如止血[1]、抗腫瘤[2]、抗菌[3]、抗輻射[4]、升白[5]、抗氧化[6-9]，等。筆者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)烏賊墨的化療保護(hù)作用進(jìn)行了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)烏賊墨對(duì)化療藥物環(huán)磷酰胺致模型動(dòng)物多種正常組織損傷均具有較強(qiáng)的緩解效應(yīng)。烏賊墨是一種黑色混合物，其中主要成分為糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等有機(jī)大分子和游離氨基酸、黑色素等有機(jī)小分子，除此，墨中還含有多種微量元素。因此，我們對(duì)前期研究對(duì)烏賊墨中發(fā)揮化療保護(hù)作用的有效成分進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)烏賊墨多糖便是活性成分之一。

對(duì)烏賊墨多糖的研究，最早見(jiàn)于日本研究人員的報(bào)道。日本學(xué)者率先對(duì)烏賊墨多糖的組成與結(jié)構(gòu)進(jìn)行了探討，他們的研究結(jié)果表明，多糖鏈為帶有分支結(jié)構(gòu)的糖胺聚糖（GAG），主鏈為葡萄糖醛酸—海藻糖（GlcA-Fuc）二糖單元的串聯(lián)重復(fù)，N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）分支于海藻糖，完整的三糖重復(fù)單元為{-3GlcAβ1-4（GalNAcα1-3）Fucα1-}n[10]，該結(jié)果被我國(guó)的研究人員再次確證[11]。目前，對(duì)烏賊墨多糖活性研究的報(bào)道十分鮮見(jiàn)。我們近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，烏賊墨多糖是烏賊墨中發(fā)揮化療保護(hù)作用的主要成分，能顯著緩解環(huán)磷酰胺對(duì)模型動(dòng)物造成的毒性損傷[12]。環(huán)磷酰胺的細(xì)胞毒性原因之一，是因?yàn)榄h(huán)磷酰胺在肝臟的代謝產(chǎn)物所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所致。在我們前期的研究中，烏賊墨多糖能顯著弱化環(huán)磷酰胺所介導(dǎo)的氧化性損傷，提升機(jī)體的抗氧化能力[12]。因此，烏賊墨多糖的化療保護(hù)效應(yīng)與其弱化環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)。為進(jìn)一步探討烏賊墨多糖的抗氧化作用，本試驗(yàn)檢測(cè)了烏賊墨在體外的抗氧化能力。研究結(jié)果將為促進(jìn)烏賊墨在保健功能食品領(lǐng)域的研究與開(kāi)發(fā)提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

烏賊墨多糖為本室制備[13-14]。

乙二胺四乙酸二鈉：廣州化學(xué)試劑廠；鐵氰化鉀：天津市巴斯夫化工有限公司；鄰苯三酚、DPPH：上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；WFZ UV-2800 AH 型紫外分光光度計(jì)：尤尼柯儀器有限公司。

1.2 總還原力測(cè)定[15]

待測(cè)樣品、磷酸緩沖液（PBS，pH6.6，2.5 mol/L）和1%K3Fe（CN）6溶液各取2.0 mL 混合，50 ℃水浴20 min，冰水冷卻后加入2.0 mL 三氯乙酸溶液（10%，TCA）混勻。3 000 r/min 離心10 min 后取上清2.0 mL，依次加入蒸餾水2.0 mL、0.1%FeCl3溶液0.4 mL，混勻靜置10 min。蒸餾水參照，測(cè)定A700nm。

1.3 羥自由基清除力測(cè)定[16]

取3.0 mL Tris 緩沖液（0.15 mol/L，pH8.2）、1.0 mL溴鄰苯三酚紅（1 mmol/L） 和1 mL EDTA-Na2-Fe（1.0 mmol/L）混合，再加入多糖試樣1.0 mL，最后加入1.0 mL 2%H2O2，混勻后放置30 min?？瞻滓哉麴s水代替試樣，對(duì)照組以蒸餾水代試樣和EDTA-Na2-Fe，測(cè)定A520nm。清除率=（A空白－A樣液）÷A空白×100%。

1.4 DPPH 自由基清除力測(cè)定[17]

取2.0 mL 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼溶液（0.2 μmol/L，DPPH）與2.0 mL 樣品混合均勻，在黑暗中放置30 min，測(cè)定A517nm。清除率=[（Ac-Ai）/Ac]×100 %（Ac：無(wú)水乙醇+DPPH 溶液的吸光度；Ai：待測(cè)液+DPPH 溶液的吸光度）。

1.5 總抗氧化能力測(cè)定[17]

標(biāo)準(zhǔn)曲線：取6.08 mg FeSO4溶于適量的水中，加入H2SO4（18 mol/L）0.25 mL，再用蒸餾水定容至50.0 mL，并置入小鐵釘。取上述溶液5.0 mL，蒸餾水定容至50.0 mL，即為800 μmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。蒸餾水倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備400、200、100、50、25 μmol/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定A593nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總抗氧化能力測(cè)定：取0.3 mL 樣品加入2.7 mL 預(yù)熱至37 ℃的三價(jià)鐵還原抗氧化能力（FRAP）工作液，混勻放置10 min，測(cè)定A593nm。樣品分別作1、2、5 倍3個(gè)稀釋度，以無(wú)水乙醇代替樣品加入FRAP 工作液作為空白，每個(gè)稀釋度做10 次平行試驗(yàn)，求平均值。根據(jù)反應(yīng)后吸光值，計(jì)算相應(yīng)FeSO4的濃度（μmol/L），定義為FRAP 值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 烏賊墨多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用

DPPH 是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其穩(wěn)定性源于苯環(huán)的空間障礙，使處于中心部位的氮原子上孤電子不能成對(duì)?；贒PPH 的單電子在517 nm 處有一強(qiáng)吸收，且其醇溶液呈紫色的特性。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于單電子配對(duì)而使吸收逐漸衰減，褪色程度與接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析。因此，DPPH 法自1958 年建立以來(lái)，廣泛用于測(cè)定生物試樣和食品的抗氧化能力。本研究采用DPPH 法測(cè)定了烏賊墨多糖體外對(duì)DPPH自由基的清除能力，檢測(cè)數(shù)據(jù)詳見(jiàn)圖1。

圖1 SIPG 對(duì)DPPH 自由基的清除能力Fig.1 Scavenging rates of SIPG at the indicated concentrations against DPPH free radicals

結(jié)果表明，在所設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對(duì)DPPH自由基的清除能力與烏賊墨多糖的濃度呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系，隨著烏賊墨多糖濃度的等量遞增，DPPH 自由基的清除率逐漸上升，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到所定最大值（14.25 mg/mL）時(shí)，對(duì)DPPH 自由基的清除能力也達(dá)到最大值。各質(zhì)量濃度間均有極顯著差異（P<0.01）。

2.2 烏賊墨多糖的總抗氧化能力

FRAP 法是一種簡(jiǎn)便快捷的測(cè)定樣品總抗氧化能力的方法。其原理是在酸性條件下，抗氧化物可以還原Fe3+-TPTZ（Ferric-tripyridyltriazine） 產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，隨后在593 nm 測(cè)定藍(lán)色的Fe2+-TPTZ 即可獲得樣品中的總抗氧化能力。由于反應(yīng)在酸性條件下進(jìn)行，可以抑制內(nèi)源性的一些干擾因素。由于樣品中Fe3+或Fe2+的總量常低于10 μmol/L，因此樣品中Fe3+或Fe2+不會(huì)明顯干擾FRAP 法的檢測(cè)反應(yīng)。另外，反應(yīng)體系中的Fe3+或Fe2+是和TPTZ 螯合的，樣品本身含有的少量金屬離子螯合劑通常也不會(huì)顯著影響檢測(cè)反應(yīng)。FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線及SIPG 總抗氧化能力，見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ferrous sulfate

圖3 SIPG 總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidation capacity of SIPG at the indicated concentrations

由圖2、圖3 可知，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，烏賊墨多糖總抗氧化測(cè)試混合液的FRAP 值隨著質(zhì)量濃度的增加而迅速增大，當(dāng)多糖的質(zhì)量濃度上升至設(shè)定最大值時(shí)，測(cè)試液的FRAP 值增大到最大值57.43，此時(shí)，多糖的總抗氧化能力最大。結(jié)果表明，烏賊墨多糖在所給定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其總抗氧化能力呈現(xiàn)正向量效關(guān)系，質(zhì)量濃度每增加2.25 mg/mL，總抗氧化能力均會(huì)出現(xiàn)顯著性增強(qiáng)（P<0.01）。

2.3 烏賊墨多糖對(duì)羥基自由基的清除能力

羥自由基是自由基中最強(qiáng)氧化劑，幾乎可以與任何大分子作用，導(dǎo)致機(jī)體受損和基因突變，引起機(jī)體衰老和癌癥的發(fā)生。本試驗(yàn)利用Fenton 反應(yīng)測(cè)定烏賊墨多糖對(duì)Fe2+催化H2O2產(chǎn)生羥基自由基的清除能力。由于羥基自由基可使溴鄰苯三酚紅褪色，所以根據(jù)褪色程度用比色法測(cè)定羥基自由基含量。根據(jù)此原理，我們可間接評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)對(duì)羥自由基的清除能力的檢測(cè)結(jié)果（圖4）類(lèi)似于上述DPPH 自由基和總抗氧化能力的變化規(guī)律。在所設(shè)定的烏賊墨多糖的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的遞增，其對(duì)羥自由基的清除能力也逐漸增強(qiáng)，依然呈現(xiàn)正向量效關(guān)系，而且，每增加一個(gè)濃度梯度，烏賊墨多糖對(duì)羥自由基的清除能力就出現(xiàn)一次顯著性上升（P<0.01）。該結(jié)果表明，烏賊墨多糖能有效的清除反應(yīng)體系中的羥自由基，發(fā)揮其抗氧化作用。

圖4 SIPG 對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.4 Scavenging rates of SIPG at the indicated concentrations against hydroxyl free radicals

2.4 烏賊墨多糖的體外還原力

Fe3+獲得待測(cè)物質(zhì)所提供的電子而被還原為Fe2+，從而使得反應(yīng)體系的顏色發(fā)生改變，表明體系中氧化還原狀態(tài)變化，體系的吸光值增大，說(shuō)明被測(cè)物質(zhì)的還原力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)。因此，利用此原理可檢測(cè)烏賊墨多糖的還原能力。SIPG 還原能力見(jiàn)圖5。

圖5 SIPG 的還原能力Fig.5 Reducing power of SIPG at the indicated concentrations

由圖5 可知，隨著烏賊墨多糖質(zhì)量濃度的增加還原力逐漸增強(qiáng)，在所選濃度范圍內(nèi)，烏賊墨多糖濃度為14.25 mg/mL 時(shí)，還原力最強(qiáng)，正向量效關(guān)系明顯。差異顯著性分析表明，各相鄰質(zhì)量濃度間均具有明顯的數(shù)據(jù)差異（P<0.01）。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從對(duì)羥自由基和DPPH 自由基的清除能力，以及總抗氧化能力和還原能力等四個(gè)抗氧化指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)了烏賊墨多糖的體外抗氧化能力。結(jié)果表明，在體外環(huán)境中，烏賊墨多糖抗氧化力明顯。該結(jié)果與本課題組前期完成的體內(nèi)抗氧化能力檢測(cè)結(jié)果一致。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)[12]，烏賊墨多糖能較大范圍內(nèi)弱化化療藥物環(huán)磷酰胺對(duì)機(jī)體所造成的氧化性損傷，提升化療模型動(dòng)物正常組織器官的抗氧化能力，減低化療給正常機(jī)體所造成的毒副作用。由此可見(jiàn)，烏賊墨多糖或許可作為腫瘤臨床治療中使用的細(xì)胞保護(hù)劑的候選藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)，必將具有重要的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。

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