袁曉峰 王 軍 周 丹 中國人民解放軍沈陽軍區(qū)赤峰醫(yī)院藥劑科（赤峰024000）

缺血性心臟病已成為危害人類健康的第一殺手。隨著冠狀動(dòng)脈內(nèi)溶栓和冠脈搭橋等內(nèi)外科治療手段的廣泛應(yīng)用，繼之出現(xiàn)的心肌缺血／再灌注（myocardia1ischemia／rePerfusion，MI／R）損傷日益受到心臟病學(xué)家的高度重視。研究表明，氧化應(yīng)激［1，2］在MI／R 損傷中發(fā)揮著重要的作用。中藥治療MI／R損傷療效確切、前景良好。許多從中藥中分離得到的化合物都具有抗MI／R 損傷的作用，其中對(duì)于丹參心肌保護(hù)作用的研究最為引人關(guān)注。

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根及根莖。近年來，臨床觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都證明丹參具有廣泛而復(fù)雜的藥理活性［3，4］。原兒茶醛是丹參中結(jié)構(gòu)最簡單的主要成分，具有鄰二酚的母核結(jié)構(gòu)，該藥效基團(tuán)是其顯著抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)［5］。因此，我們推測(cè)該藥物具有保護(hù)MI／R 損傷的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究原兒茶醛對(duì)大鼠MI／R 損傷的保護(hù)作用。

1 材料 1.1動(dòng)物 SD 雄性大鼠，250±20g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)期間提供足量的自來水及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的普通飼料，動(dòng)物室保持22℃，自然通風(fēng)，相對(duì)濕度60%～70%，光照周期8：00～20：00。適應(yīng)7d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 原兒茶醛購自貴州迪達(dá)科技有限公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase－MB，CK－MB），肌鈣蛋白（cardiac troPonin，cTnI）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）等試劑盒由上海西唐生物技術(shù)公司提供；2，3，5－氯化三苯基四氮唑藍(lán)（Tetrazolium chloride，TTC）染色劑由中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司提供；伊文思藍(lán)（Evans Blue，EB）由美國Sigma－Aldrich公司提供。

1.3 主要儀器 HX－100E小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）；TDZ4A－WS低速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；COOLPIX S1 型照相機(jī)（Nikon公司，日本）；5417型低溫高速離心機(jī)（EPPendorf公司）。

2 方法 2.1 大鼠MI／R 模型制備 大鼠稱重后，2 mL／kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉，仰臥位固定，連接心電圖監(jiān)測(cè)，氣管插管并接呼吸機(jī)（頻率：75次／min；潮氣量：8～9 mL；吸：呼＝1：2），胸骨左緣旁縱行切開第3～5肋間做橫行切口，剪開并挑起心包，暴露心臟，以左心耳與肺動(dòng)脈圓錐交界處的左冠狀動(dòng)脈前降支（Left anterior descending coronary aery，LAD）為標(biāo)志，于左心耳下方1～2mm 處進(jìn)針、穿線（橫跨左冠狀動(dòng)脈前降支），將一小硅膠管從絲線兩端穿入，穩(wěn)定10 min后結(jié)扎，缺血30 min后，再灌注3h 結(jié)束。成功標(biāo)準(zhǔn)［7］：結(jié)扎LAD 后心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST 段出現(xiàn)弓背向上抬高，T 波高聳等為缺血成功；放松結(jié)扎線后，抬高的ST 段下降1／2以上為再灌注成功。假手術(shù)組動(dòng)物只穿線，不結(jié)扎，其余兩組均進(jìn)行30 min缺血和3h再灌注。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將大鼠隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組，模型組，原兒茶醛組（5，10，20 mg／kg）。假手術(shù)組穿線，但不結(jié)扎；模型組頸靜脈注射生理鹽水，給藥組給予頸靜脈注射原兒茶醛水溶液。給藥時(shí)間為再灌注即刻。

2.3 心肌梗死面積測(cè)定［6］再灌注3h后，再次結(jié)扎各組大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支，從頸動(dòng)脈迅速注入3% EB 溶液2 mL，待大鼠口唇及四肢末梢皮膚藍(lán)染后迅速摘除心臟，濾紙吸除心室腔中殘余染液，－80℃凍存。取出后自心尖向心底平行房室溝方向?qū)⑵淝谐上嗟群穸鹊?片，2%TTC溶液（PH＝7.4）37℃孵育10min，4%多聚甲醛固定過夜。染色后白色代表梗塞區(qū)（area of necrosis，AN），紅色代表缺血但未梗塞區(qū)，藍(lán)色代表正常區(qū)，危險(xiǎn)區(qū)（area at risk，AAR）為紅色和白色面積之和［7，8］。采用Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。梗塞程度采用梗塞區(qū)面積（AN）與危險(xiǎn)區(qū)面積（AAR）的比值表示。

2.4 血清生化指標(biāo)測(cè)定 再灌注3h后，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，離心（4000r／min）12 min，試劑盒檢測(cè)CK－MB，cTnI和LDH 的活性。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為，使用ANOVA 進(jìn)行多組均數(shù)之間差別的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD 法。采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果 3.1 原兒茶醛對(duì)MI／R 損傷大鼠心肌梗塞面積的影響 模型組心肌梗塞面積嚴(yán)重，給予原兒茶醛后，給藥組梗塞面積有所下降。原兒茶醛（10）及原兒茶醛（20）兩個(gè)劑量組與模型組比較，梗塞面積均降低（P ＜0.05）。詳見圖1，表1。

圖1 原兒茶醛對(duì)大鼠MI／R 損傷心肌梗塞面積的影響

表1 原兒茶醛對(duì)大鼠MI／R 損傷心肌梗塞面積的影響（±s，n＝6）

表1 原兒茶醛對(duì)大鼠MI／R 損傷心肌梗塞面積的影響（±s，n＝6）

注：△P ＜0.05 vs 模型組。

組別模型組原兒茶醛（5）原兒茶醛（10）原兒茶醛（20梗塞面積（%）41.28±6.15 30.34±5.86 27.67±5.51△24.34±3.25△

3.2 原兒茶醛對(duì)大鼠MI／R 損傷血清中CK－MB，cTnI和LDH 的影響 與假手術(shù)比較，模型組血清CK－MB，cTnI和LDH 水平顯著升高（P ＜0.05）；原兒茶醛（20）組與模型組比較，血清CK－MB，cTnI和LDH 水平均顯著下降（P ＜0.05），詳見表2。

表2 原兒茶醛對(duì)大鼠MI／R 損傷血清CK－MB，cTnI和LDH 的影響（±s，n＝6）

表2 原兒茶醛對(duì)大鼠MI／R 損傷血清CK－MB，cTnI和LDH 的影響（±s，n＝6）

注：△P ＜0.05 vs 假手術(shù)組；▲P ＜0.05 vs 模型組。

組別CK－MB（ng／mL） cTnI（ng／mL）LDH（U／L）假手術(shù)組37.19±15.06 2.95±0.83 18450.50±524.16模型組92.03±12.38■ 12.39±2.30■51981.02±1341.67原兒茶醛（5）83.81±12.44 10.35±1.06 49419.67±764.63原兒茶醛（10）76.33±9.75 44.20±17.07▲33921.12±872.96▲原兒茶醛（20） 10.02±1.42▲7.38±1.20▲ 20872.29±717.21▲△

4 討 論 研究普遍認(rèn)為心肌缺血期間的損傷為再灌注損傷的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)，再灌注損傷是缺血損傷的延續(xù)、擴(kuò)大和惡化［9］。隨著心臟血流的重建，左心室功能得到改善，這部分心肌將得以保全。如能合理使用抗再灌注損傷藥物，將大大減少再灌注損傷帶來的危害［10］。

隨著氧自由基（OFR）在疾病中的研究日趨深入，大量資料證實(shí)氧自由基與MI／R 損傷的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。較為一致的觀點(diǎn)認(rèn)為，由于種種致病因子的作用，導(dǎo)致OFR 蓄集，OFR 使細(xì)胞膜上的脂質(zhì)產(chǎn)生過氧化而生成過氧化脂質(zhì)（LPO），LPO 進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及功能，而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［11－14］。大量研究表明原兒茶醛具有較好的清除氧自由基的活性［5］。本研究觀察了原兒茶醛治療MI／R 損傷的保護(hù)作用，為其開發(fā)成臨床用藥奠定了理論基礎(chǔ)。

梗塞面積被認(rèn)為是衡量MI／R 損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，而心肌保護(hù)正是以縮小梗塞面積為前提的，臨床上心肌梗塞面積的大小直接關(guān)系到患者的預(yù)后［15］。通過測(cè)量大鼠心臟梗塞面積，我們發(fā)現(xiàn)原兒茶醛能夠顯著降低心肌梗塞面積，提示原兒茶醛對(duì)再灌注時(shí)的心肌具有良好的保護(hù)作用。此外，心肌損傷特異性的酶也是臨床診斷心肌缺血／再灌注損傷的指標(biāo)。其中CK－MB，cTnI和LDH 為細(xì)胞內(nèi)重要的能量代謝酶，是急性心肌損傷的血清標(biāo)志物［16］。MI／R 損傷大鼠血清中的CK－MB，cTnI和LDH 含量均明顯升高；而原兒茶醛能夠降低大鼠血清中的CK－MB，cTnI和LDH 水平。通過以上藥效學(xué)指標(biāo)，我們證實(shí)原兒茶醛在MI／R 損傷中具有良好的心肌保護(hù)作用。

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