陳 婷,吳繼美,李任強

(暨南大學生物工程學系,廣東廣州510632)

陳 婷,吳繼美,李任強

(暨南大學生物工程學系,廣東廣州510632)

利用QSepharoseTM-XL強陰離子交換色譜從蝦的精氨酸激酶粗提液中純化出精氨酸激酶,以其免疫大白兔,然后利用QSepharoseTM-XL強陰離子交換色譜從高免疫兔血清中純化精氨酸激酶的多克隆抗體。采用SDS-PAGE檢測精氨酸激酶及其抗體的純度,并進行了活性測定。結果表明,利用QSepharoseTM-XL強陰離子交換色譜純化出的精氨酸激酶及其多克隆抗體純度高、活性強。建立了快速高效、操作方便而又適合實際應用的制備精氨酸激酶及其多克隆抗體的方法,可為精氨酸激酶及食品過敏的相關研究提供幫助。

QSepharoseTM-XL強陰離子交換色譜;精氨酸激酶;多克隆抗體;純化

精氨酸激酶(ATP:精氨酸N-磷酸轉(zhuǎn)移酶,EC 2.7.3.3.Argininekinase,AK)是磷酸原激酶家族的一員,對于調(diào)節(jié)無脊椎動物磷酸精氨酸與ATP之間能量的平衡具有重要作用[1],還與機體的病原識別、免疫反應等多種重要的生理過程密切相關[2-4]。近年來的一系列研究表明,AK在肌肉組織內(nèi)大量表達[5],為甲殼類動物體內(nèi)最重要的致敏原之一[6,7]。雖然目前對于AK的基因克隆表達、分子結構、催化特性等的研究較多[8],但直接從甲殼類動物中提取純化AK的報道不多,且分離純化方法普遍較繁雜、效率不高,如姚翠鸞等[9]采用CM-纖維素批量層析、SephadexG-100柱層析、DEAE-纖維素柱層析等多個步驟從凡納濱對蝦中分離純化AK。因此,若能快速高效地直接從動物組織中純化出AK,對于開展AK的研究是相當有實用意義的。

作者利用QSepharoseTM-XL強陰離子交換色譜[10]分離純化AK,同時,針對AK是過敏原,用純化了的AK進行動物免疫,并采用QSepharoseTM-XL強陰離子交換色譜對AK多克隆抗體進行純化,從而建立了一種成本低、快速有效的制備AK多克隆抗體的方法。為海產(chǎn)品食物中基于AK過敏的相關檢測研究奠定了基礎。

1 實驗

1.1 材料與試劑

新西蘭大白兔,暨南大學實驗動物中心;刀額新對蝦(基圍蝦)購于廣州石牌市場。

QSepharoseTM-XL樹脂,GEHealthcareBio-SciencesAB;辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG、脫脂奶粉、苯甲基磺酰氟(PMSF)、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑,Sigma公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris),廣州健陽生物科技有限公司;其它試劑均為分析純或化學純,廣州化學有限公司。

1.2 AK的純化與活性檢測

1.2.1 AK粗提液的制備

根據(jù)Yu等[11]的方法作少量改進。所有操作均在4℃下進行。

取新鮮蝦肉,加入預冷的緩沖溶液A(0.1mol· L-1Tris-HCl、10mmol·L-1巰基乙醇、1mmol· L-1EDTA、5μmol·L-1NaN3、25μmol·L-1PMSF,pH值8.0),用組織搗碎機磨成勻漿;繼續(xù)加緩沖溶液A至5倍體積,抽提16h,12000r·min-1離心20min,收集上清液;上清液加硫酸銨至飽和度70%,靜置2h,12000r·min-1離心20min,取上清;繼續(xù)加硫酸銨至飽和度達90%,靜置2h,12000r·min-1離心20 min,取沉淀;用緩沖溶液B(10 mmol· L-1Tris-HCl、10 mmol·L-1巰基乙醇、0.1 mmol· L-1EDTA,p H值8.0)溶解,繼續(xù)用緩沖溶液B透析,得AK粗提液。

1.2.2 AK的純化

取Q SepharoseTM-XL強陰離子交換樹脂進行溶脹、洗滌、抽氣等處理后裝柱(20 cm×1.5 cm),連接好洗脫檢測儀(以280 nm處的光吸收值OD280監(jiān)測洗脫液),以0.5 m L·min-1流速用平衡緩沖溶液(0.02 mol·L-1Tris-HCl,p H值8.0)平衡柱子8 h以上;取5 m L AK粗提液,用平衡緩沖溶液稀釋10倍,以0.5 m L·min-1流速上樣至已平衡好的Q SepharoseTM-XL色譜柱,繼續(xù)用平衡緩沖溶液洗脫使洗脫液的OD280至基線后(趨于0),用0.1～1 mol·L-1的NaCl溶液以0.5 m L·min-1的流速進行梯度洗脫,收集各洗脫峰;將各洗脫組分用平衡緩沖溶液透析后,真空冷凍干燥濃縮,采用還原性SDS-PAGE進行純度鑒定和分子量測定。

1.2.3 AK活性的檢測

AK活性的檢測采用改進的p H值比色法[12],在25℃下進行。反應液體系包括:2 mmol·L-1ATP, 10 mmol·L-1精氨酸,復合酸堿指示劑(0.15%麝香草酚藍+0.025%甲酚紅),50 mmol·L-1乙酸鎂, 50 mmol·L-1Tris-HCl,p H值8.0。取1 m L反應液于塑料比色杯中,加入10μL酶液(樣液),迅速混合,測定1 min內(nèi)575 nm處吸收值的減少值。

1個酶活力單位定義為:在上述條件下,1 min內(nèi)AK催化磷酸精氨酸反應產(chǎn)生1μmol H+所需的酶量。

1.3 多克隆抗體血清的制備

將純化的AK與完全弗氏佐劑等體積混合乳化,采用多點背部皮下注射方式對體重約3 kg的雌性新西蘭大白兔進行免疫(500μg·只-1)[13]。共進行3次加強免疫后從兔耳動脈取血,采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[14]檢測動物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體滴度,當?shù)味确弦蠛笫占醚濉?/p>

1.4 多克隆抗體的分離純化與活性檢測

參照文獻[10]分別進行免疫和不免疫(陰性)血清中多克隆抗體的純化。取1.0 m L收集到的血清,用0.02 mol·L-1p H值8.0的Tris-HCl緩沖溶液稀釋至10 m L,以0.3 m L·min-1流速上樣至已平衡好的Q SepharoseTM-XL強陰離子交換色譜柱,用平衡緩沖溶液繼續(xù)過柱,收集在280 nm波長處有吸收值(OD280)的洗出液,當穿透峰的OD280降至基線時,用含0.05 mol·L-1NaCl的0.02 mol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(p H值6.0)進行洗脫,收集洗脫峰;當OD280再次降至基線后,用1 mol·L-1NaCl溶液進行洗脫并收集洗脫峰。將各洗脫液用去離子水透析后,真空冷凍干燥濃縮,分別使用非還原性SDS-PAGE和還原性SDS-PAGE進行鑒定。非還原性電泳分離膠濃度為8%,濃縮膠濃度為4%;還原性電泳分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為4%。采用電泳分析系統(tǒng)對電泳圖像進行分析。

用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各蛋白樣品的濃度。抗原為AK,以兔陽性血清的抗體為實驗組,兔陰性血清的抗體為對照組,通過間接ELISA檢測已純化的抗體的活性。

2 結果與討論

2.1 AK的純化與活性

Q SepharoseTH-XL強陰離子交換色譜柱用0.1～1 mol·L-1NaCl溶液梯度洗脫,得到2個明顯的洗脫峰(圖1中峰2、3),對峰2部分進行SDS-PAGE鑒定,結果如圖2所示。

圖1 Q SepharoseTM-XL強陰離子交換色譜分離精氨酸激酶的色譜圖Fig.1 Elution profile of arginine kinase with Q SepharoseTM-XL strong anion exchange chromatography

色譜和電泳鑒定結果表明,AK粗提液中AK含量高,但雜蛋白也較多,它們都完全被吸附到Q SepharoseTM-XL色譜柱上。峰2部分雖有2條帶,但主要蛋白相對分子質(zhì)量約為40 ku,與AK的相對分子質(zhì)量相當,電泳密度掃描顯示其純度大于95%。因此,色譜柱分離得到的洗脫峰2是AK,純度高,達到了實驗的要求。對峰2部分進行AK活性測定,其活力約為240 U·mg-1,具有正常的活力,進一步驗證了其為AK。

2.2 Q SepharoseTM-XL色譜柱對血清中Ig(抗體)的分離純化

圖2 精氨酸激酶的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE Analysis of arginine kinase

圖3 Q SepharoseTM-XL強陰離子交換色譜分離精氨酸激酶多克隆抗體的色譜圖Fig.3 Elution profile of arginine kinase polyclonal antibody with Q SepharoseTM-XL strong anion exchange chromatography

Q SepharoseTM-XL強陰離子交換色譜分離陽性樣液得到的洗脫峰5(圖3)部分經(jīng)非還原性SDSPAGE檢測其蛋白絕大部分為一條帶(圖4a,泳道2),經(jīng)計算其相對分子質(zhì)量約為150 ku,與相對分子質(zhì)量為150 ku的Ig相當。同樣純化方法得到的陰性對照也與相對分子質(zhì)量為150 ku的Ig相當(圖4a,泳道4)。而在還原性SDS-PAGE中,該蛋白呈現(xiàn)2條帶(圖4b,泳道2與4),相對分子質(zhì)量分別為50 ku和25 ku,與文獻報道的Ig有一條重鏈和一條輕鏈的相對分子質(zhì)量相符合[15],說明洗脫峰5為AK的多克隆抗體和陰性抗體,經(jīng)電泳密度掃描分析,獲得的抗體純度在95%以上,純度較高。

圖4 血清抗體的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE Analysis of serum antibody

2.3 間接ELISA檢測Ig(抗體)的活性

為了證明所純化出的目標物是AK抗體且具有正?；钚?除了進行SDS-PAGE鑒定,還對目標物進行活性檢測,結果見圖5。

由圖5可以看出,在實驗組中,隨著純化陽性抗體濃度的增大,其對應的OD450逐漸增大,并呈線性關系,相關系數(shù)R2達0.994。而陰性對照組中,隨著純化陰性抗體濃度的增大,其對應的OD450一直維持在0.3,并與空白對照組(磷酸緩沖溶液)的OD450接近(數(shù)據(jù)未列出)。表明通過Q SepharoseTM-XL強陰離子交換色譜從陽性血清中純化出的目標蛋白就是保持正常生物活性的AK多克隆抗體。

2.4 討論

Q SepharoseTM-XL樹脂是一種高容量強陰離子吸附劑,以瓊脂糖凝膠Sepharose XL作為載體偶聯(lián)葡聚糖鏈、強Q陰離子基團以醚鍵牢固結合于葡聚糖鏈上發(fā)揮作用。離子交換色譜是依賴于不同蛋白吸附于離子交換劑能力的不同[16]進行純化的一種簡單快捷的技術,具有交換容量大、重復利用率高[17]等優(yōu)點。本實驗證明,對于AK粗提液,利用Q SepharoseTMXL強陰離子交換色譜能一步純化出高純度的AK,建立了一種快速有效、操作相對簡單的直接從生物組織中分離純化AK的方法。

圖5 陽性抗體間接ELISA檢測結果Fig.5 Indirect ELISA results of purified positive antibody

目前純化抗體大多采用A蛋白親和色譜法[18-20],一般是在p H值為3的酸性條件下進行洗脫獲得的,這類方法容易使部分抗體失活或者降低生物活性。另外,血清白蛋白(SA)和免疫球蛋白(IgG)是血清中含量最多的兩種蛋白,它們的等電點分別約為4.8和7.8[21],差別較大,這為利用離子交換色譜分離它們提供了依據(jù)。本實驗先將血清中幾乎所有蛋白吸附于色譜柱上,再選擇在p H值為6.0時進行洗脫,可將SA和IgG分開而獲得較純的抗體(Ig),且抗體活性容易保持。本實驗成功快速純化出了具有正?；钚缘目贵w,建立了成本低、快速高效、適合實際應用的制備AK多克隆抗體的方法。

3 結論

在p H值8.0下,從蝦組織獲得的AK粗提液中的全部蛋白都完全被吸附到Q SepharoseTM-XL強陰離子交換色譜柱上,通過0.1～1 mol·L-1NaCl溶液的梯度洗脫,純度大于95%又有正?；钚缘腁K被單獨洗脫而得以純化。將純化的AK免疫大白兔,同樣利用Q SepharoseTM-XL強陰離子交換色譜柱從高免疫兔血清中分離純化出AK多克隆抗體,得到的AK多克隆抗體具有正?；钚?純度大于95%。本研究建立了快速高效、操作方便而又適合實際應用的制備AK及其多克隆抗體的方法。

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Study on Fast Purification of Arginine Kinase and Its Polyclonal Antibody via Q SepharoseTM-XL Strong Anion Exchange Chromatography

CHEN Ting,WU Ji-mei,LI Ren-qiang
(Department of Biotechnology,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

Q SepharoseTM-XL strong anion exchange chromatography was used to purify shrimp arginine kinase from arginine kinase crude extract.After the white rabbit was immunized using arginine kinase,the hyperimmune sera was collected and Q SepharoseTM-XL strong anion exchange chromatography was again used to purify arginine kinase polyclonal antibody from these sera.The high purity and activity of arginine kinase and its polyclonal antibody purified by Q SepharoseTM-XL strong anion exchange chromatography had been proved by SDS-PAGE.Laboratory method for fast and efficiently purification of arginine kinase and its polyclonal antibody has been built,which would be helpful for arginine kinase study and food allergies research.

Q SepharoseTM-XL strong anion exchange chromatography;arginine kinase;polyclonal antibody; purification

TQ464.7

A

1672-5425(2013)03-0067-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.018

2013-01-09

陳婷(1987-),女,湖北鄂州人,碩士研究生,研究方向:分子細胞生物學;通訊作者:李任強,教授,E-mail:trqli@jnu.edu. cn。