張吉鹍，張震宇，吳文旋，李龍瑞，鄒慶華

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；4.江西新天地藥業(yè)有限公司獸藥研究院，江西 峽江 331400)

山羊飼喂稻草基礎日糧并補飼適量的苜蓿，由于飼料間的組合效應，提高了稻草在瘤胃的發(fā)酵率、消化道各部位營養(yǎng)物質(zhì)流通量與微生物蛋白的合成效率以及山羊氮的沉積率。但當?shù)静莼A日糧補飼的苜蓿超過50%，由于可發(fā)酵有機物的不足而發(fā)生能氮不配對發(fā)酵，使得補飼苜蓿對提高稻草基礎日糧氮利用效率的組合效應降低[1–2]。譚支良[3]研究了綿羊日糧中結(jié)構(gòu)性碳水化合物(SC)與非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(NSC)的比例、過瘤胃蛋白(UDP)與瘤胃降解蛋白(RDP)比例及其相互作用對瘤胃動力學及日糧營養(yǎng)物質(zhì)在十二指腸的流通量，但未就十二指腸氨基酸的流量進行研究。卜登攀[4]的研究證明，提高日糧的能氮同步性，可增加瘤胃的液相流通速率，促進瘤胃微生物的合成，提高十二指腸食糜氨基酸的流量。筆者在研究山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿對消化道各部位營養(yǎng)物質(zhì)流通量影響[2]的基礎上，進一步研究苜蓿補飼水平對瘤胃動力學參數(shù)、十二指腸氨基酸流量的影響，旨在從十二指腸氨基酸流量與氨基酸組成模式進一步探討山羊稻草基礎日糧補飼苜蓿增加瘤胃微生物氮利用效率的組合效應機理。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選9 只體況良好，體重相近((41.3±1.2) kg)，安裝有永久性瘤胃瘺管、十二指腸瘺管、回腸瘺管的成都麻羊半同胞羯羊進行試驗。

1.2 試驗設計

根據(jù)前期體外批次發(fā)酵的組合效應研究結(jié)果[5]，決定在山羊稻草基礎日糧中分別補飼25%、50%與75%的苜蓿，即將稻草與苜蓿干草(MSL)分別以75∶25(MSL25)、50∶50 (MSL50)與25∶75(MSL75) 的比例組成3 個混合粗飼料，并制成草塊。

試驗采用單因子3 處理重復設計，按體重相似和隨機方法將試驗羊只分成3 組，每組3 只，分別飼以3 組混合粗飼料，以探討山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿(25%、50%與75%)對山羊瘤胃動力學參數(shù)、十二指腸氨基酸流量的影響。

試驗羊單籠飼養(yǎng)，預試期14 d，正試期7 d，每日于6：00 和18：00 飼喂，自由飲水，常規(guī)光照、驅(qū)蟲與管理。

1.3 消化道食糜流通量測定

1.3.1 標記物制備

選用Co–EDTA 為食糜標記物，根據(jù)Uden 等[7]的方法制備：稱取25 g 乙酸鈷、29.2 g 乙二胺四乙酸和4.0 g 氫氧化鈉放入2 L 燒杯中，加入200 mL蒸餾水，加熱至80 ℃溶解，冷卻后再加入20 mL 30%過氧化氫溶液，室溫放置4 h 后，加入300 mL 體積分數(shù)為95%的乙醇溶液，置于冰箱12 h 后，經(jīng)定性濾紙過濾并用體積分數(shù)為85%的乙醇溶液沖洗數(shù)遍。收集濾紙上粉紅色物質(zhì)于瓷盤中，置于100 ℃烘箱中烘干即可。實測該Co–EDTA 標記物Co 含量為14.08%。

1.3.2 灌注液配制

啟動灌注液配制：稱取Co–EDTA 3.6 g 定容至1 200 mL，質(zhì)量濃度約為4.20×10–4g/L。

連續(xù)灌注液配制：稱取Co–EDTA 20 g 定容至70 L，質(zhì)量濃度約為4.0×10–5g/L 。

1.3.3 標記物的灌注及采樣

預試期結(jié)束后，在正試期的第1 天早晨8:00 開始啟動灌注。將100 mL 啟動灌注液通過注射器經(jīng)采樣管迅速注入瘤胃內(nèi)不同位點。灌注完畢后，用采樣管盡量充分攪勻瘤胃液，并抽取瘤胃液反復沖洗采樣管和注射器，沖洗瘤胃液應及時灌回瘤胃內(nèi)，緊接著進行連續(xù)灌注。連續(xù)灌注采用一次性輸液器進行，調(diào)整流速約為1.40 mL/min，每天灌注連續(xù)灌注液2 000 mL，連續(xù)灌注7 d。從連續(xù)灌注的第5 天開始，采集瘤胃、十二指腸食糜樣本。采集方法是拔掉瘺管塞，使食糜自動流出，并收集于塑料采樣瓶內(nèi)。每日采樣4 次，連續(xù)采集3 d。每日采樣時間交替變化，每隔6 h 采集瘤胃食糜50 mL，十二指腸食糜15 mL。采樣時間點，第1 天：01：00、07：00、13：00、19：00；第2 天：03：00、09：00、15：00、21：00；第3 天：05：00、11：00、17：00、23：00。

將3 d 內(nèi)不同時間點采集的瘤胃、十二指腸食糜等量混合制成混合樣本，冷凍干燥，以備測其中的干物質(zhì)(DM)、總氮、Co 濃度和氨基酸等成分。

1.4 測定方法

1.4.1 混合樣本干物質(zhì)(DM)的測定

按照文獻[8]方法進行。

1.4.2 Co 的測定

瘤胃液相Co 的測定：取10 mL 瘤胃液于4 000 r/min 離心10 min，取上清液直接上機測定。食糜Co 濃度測定：稱取食糜樣品約0.5 g，放入25 mL坩堝中，置于馬福爐內(nèi)，在400 ℃下灼燒2 h，冷卻后加入3 mol/L HNO3和3mol/L HCl 溶解所得灰分，過濾，將濾液定容至25 mL。取濾液，用原子吸收光譜儀進行Co 的測定。

1.4.3 十二指腸食糜微生物蛋白質(zhì)測定

采用Zinn 等[9]建立的嘌呤法測定。

1.4.4 氨基酸測定

將食糜凍干樣在6 mol/L HCl 下水解22 h 后，減壓蒸干，用0.02 mol/L HCl 重新溶解定容后，用日立835 型氨基酸自動分析儀測定。

1.5 計算方法

1.5.1 食糜流通量的計算

先擬合出瘤胃食糜標記物中鈷濃度(Ct)與時間(t)的遞降曲線Ct=C0×e–kt，計算出停止灌注標記物時瘤胃食糜中初始標記物濃度C0和瘤胃食糜流通速率常數(shù)Kp 值(即曲線的K 值，也就是瘤胃液相小數(shù)稀釋率)，按下列公式進行相關(guān)指標的計算。 瘤胃液相食糜流通速率F(L/h)，

十二指腸食糜流通量QD(g/d)，

1.5.2 瘤胃液相體積

瘤胃液相體積V(L)，

1.5.3 食糜內(nèi)養(yǎng)分流通速率

食糜內(nèi)養(yǎng)分流通速率(mg/h)=食糜內(nèi)養(yǎng)分濃度×食糜流通速率。

1.5.4 微生物氮(MN)流通量

微生物氮(MN)流通量(QMN)(g/d)

1.5.5 氨基酸流通量

氨基酸流通量(DFAAi)(g/d)，

DFAAi=CDAAi×QD

式中：DFAAi 為十二指腸食糜中第i 種氨基酸流通量；CDAAi 為第i 種氨基酸含量；QD為十二指腸食糜流通量。

1.6 統(tǒng)計分析

用SAS(6.12)軟件的一般線性模型(GLM)程序進行方差分析和鄧肯氏多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻草補飼苜蓿對山羊瘤胃動力學及微生物蛋白合成的影響

稻草補飼不同水平苜蓿后，山羊瘤胃液相小數(shù)稀釋率、瘤胃液相外流速率、瘤胃液相體積、瘤胃液相MCP 庫容量、MCP 流通速率及MCP 流通量見表1。由表1 可知，稻草補飼苜蓿對瘤胃液相小數(shù)稀釋速率影響不顯著(P＞0.05)，但對液相外流速率、瘤胃液相體積及微生物蛋白質(zhì)合成的影響在一些組間差異顯著(P＜0.05)。3 個試驗組瘤胃小數(shù)稀釋速率基本接近。瘤胃液相外流速率、MCP 流通速率均以MSL50 最高，MSL75 與之接近，MSL25 最低，與MSL50、MSL75 的相應值差異均顯著(P＜0.05)。瘤胃液相體積亦以MSL50 的最高，要顯著高于MSL75 與MSL25 的(P＜0.05)，其中MSL75與MSL25 的組間差異不顯著(P＞0.05)。瘤胃液相MCP 庫(細菌氮合成–流出后的凈平衡值)容量隨MSL 補飼水平的增加而增加，但MSL50 與MSL25、MSL75 的差異不顯著(P＞0.05)，其余組間差異顯著(P＜0.05)。MCP 流通量亦隨MSL 補飼水平的增加而增加，其自高到低的排序為MSL75、MSL50、MSL25，其中MSL75 與MSL50 的組間差異不顯著(P＞0.05)。

表1 山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿的瘤胃動力學參數(shù)及微生物蛋白質(zhì)流通量

2.2 稻草補飼苜蓿對山羊十二指腸含氮物質(zhì)流通量的影響

稻草補飼不同水平苜蓿，山羊十二指腸含氮物質(zhì)流通量見表2。由表2 可知，MSL25、MSL50 與MSL75 的十二指腸微生物氮流量、十二指腸非微生物氮流量均隨MSL 補飼水平的增加而增加，差異顯著(P＜0.05)。微生物氮占總氮的百分比(MN/TN)亦隨MSL 補飼水平的增加而增加，但MSL50 與MSL25、MSL75 的差異不顯著(P＞0.05)，其余組間差異顯著(P＜0.05)。MSL50 的微生物氮流量較MSL25 提高6.27%，MSL75 較MSL50、MSL25 則分別提高4.04%與10.56%，而MSL50 的MSL 補飼量是MSL25 的2 倍，MSL75 的MSL 補飼量則分別為MSL50、MSL25 的1.5 倍與3 倍，表明稻草基礎日糧補飼苜蓿的山羊十二指腸微生物氮流量隨MSL 補飼水平的增加呈降低的趨勢，當超過50%時，出現(xiàn)拐點。十二指腸非微生物氮流量、十二指腸微生物氮流量占總氮流量的百分比亦呈現(xiàn)類似的變化。

表2 山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿的十二指腸含氮物質(zhì)流通量

2.3 稻草補飼苜蓿對進入十二指腸食糜內(nèi)氨基酸流量的影響

稻草補飼不同水平苜蓿對山羊十二指腸食糜內(nèi)必需氨基酸(EAA)與非必需氨基酸(NEAA)流量的影響見表3、表4。由表3、表4 可知，稻草補飼不同水平苜蓿對進入十二指腸食糜內(nèi)各種氨基酸、總必需氨基酸(TEAA)、總非必需氨基酸(TNEAA)以及總氨基酸(TAA)均有顯著影響(P＜0.05)。除個別氨基酸及總必需氨基酸外，總的趨勢是補飼苜蓿水平越高，氨基酸的流量越高，差異顯著(P＜0.05)。除苜蓿蛋白含有較高的EAA[9–10]外，亦與補飼MSL增加了瘤胃細菌蛋白質(zhì)產(chǎn)量有關(guān)[1]。細菌蛋白質(zhì)富含Arg、Leu、Lys、Ile、Thr、Gly、Glu 和Ala 等氨基酸[11–12]，本試驗中Arg、Leu、Lys、Ile、Thr、Gly、Glu 和Ala 流量均受MSL 補飼的影響，這是因為補飼苜蓿提高了微生物氮流量，因此這幾種氨基酸流量的增加可能主要與進入十二指腸的瘤胃細菌蛋白質(zhì)合成量提高有關(guān)。由于十二指腸內(nèi)氨基酸的流量不僅來自日糧的過瘤胃蛋白(UDP)和瘤胃MCP，同時也有內(nèi)源氨基酸的貢獻，如脫落的細胞及細胞分泌等，故有關(guān)苜蓿補飼對進入小腸的氨基酸數(shù)量與平衡方面的研究還有待進一步深入。

表3 山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿的十二指腸食糜必須氨基酸流量 g/d

表4 山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿的十二指腸食糜非必須氨基酸流量 g/d

3 討 論

a.適量補飼苜蓿，可增加山羊瘤胃微生物蛋白流量。液相流通速率是水、可溶性飼料成分和被微生物降解的可溶性養(yǎng)分的流通速率。含氮物質(zhì)和能量載體物質(zhì)在瘤胃降解及二者被微生物整合利用狀況，除與微生物對其分解程度有關(guān)外，還與流通速率有關(guān)。流通速率快時，微生物周轉(zhuǎn)加快，對飼料的降解率降低，過瘤胃比例提高。由于流通速率的增加，日糧同步性高而流通速率快，則可減少瘤胃內(nèi)能量和氮素的再循環(huán)，減少微生物細胞自溶和維持需要，從而能增加進入小腸的MCP 流量[4]。本研究MCP 流通量隨MSL 補飼水平的增加而非線性增加，且MSL75 與MSL50 的組間差異不顯著，表明山羊稻草基礎日糧補飼苜蓿，可以改善日糧的能氮平衡，增加MCP 的合成量，同時還表明，補飼苜蓿要適度，超過這個“度”(本研究為50%)，改善日糧能氮平衡、增加MCP 產(chǎn)量的組合效應不明顯。 b.適量補飼苜蓿，可增加山羊十二指腸氨基酸流量 。本研究3 組混合粗飼料的十二指腸微生物氮流量為3.03～3.35 g/d，平均為3.20 g/d，這在其他學者報道的范圍之內(nèi)[4，13–14]。瘤胃每天MCP 總產(chǎn)量與瘤胃可利用能密切相關(guān)[15–16]，反芻動物秸稈基礎飼料補飼苜?？梢源龠M纖維分解菌的生長，從而提高秸稈的消化率[17]，增加了稻草中的可發(fā)酵物質(zhì)，使得能氮更趨平衡，從而增加了瘤胃MCP 的產(chǎn)量，也就增加了進入十二指腸微生物蛋白的流量，進而增加了十二指腸的氨基酸流量，但這種增加并非隨稻草基礎日糧中苜蓿的增加而線性增加，當MSL 補飼量超過50%時，總必需氨基酸流量的增加不顯著，一些氨基酸的流量甚至減少。表明繼續(xù)增加MSL 補飼量，由于可發(fā)酵有機物的不足會導致能氮不平衡而減少十二指腸氨基酸流量的增幅，造成優(yōu)質(zhì)干草苜蓿的浪費。

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[2]張吉鹍，張震宇，吳文旋，等．山羊稻草基礎日糧補飼不同水平苜蓿對消化道各部位營養(yǎng)物質(zhì)流通量的影響研究[J]．江西農(nóng)業(yè)大學學報，2013，35(6)：待發(fā)表．

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