蘇建明，伍小松，朱鑫，陳韜

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

C–反應(yīng)蛋白(C–reactive protein,CRP)是一種急性時(shí)相血清蛋白，屬于Pentraxin 蛋白家族，與動(dòng)物的天然免疫和炎癥反應(yīng)有密切的關(guān)系[1–2]。CRP能與細(xì)菌、真菌以及寄生蟲細(xì)胞膜上的磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)以及凋亡壞死細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)破壞時(shí)暴露的磷脂、脂蛋白、脂多糖、染色質(zhì)、半乳糖和膽固醇等多種配體結(jié)合，具有與IgG 和補(bǔ)體相似的調(diào)理和凝集作用[3–5]，能提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能[6–8]，刺激單核細(xì)胞表面的組織因子表達(dá)及其他免疫調(diào)節(jié)功能[9–11]，因此，血清CRP 水平的高低取決于炎癥刺激的強(qiáng)度[2]。

由于魚類的免疫系統(tǒng)比哺乳動(dòng)物低等，天然免疫在機(jī)體的免疫保護(hù)中所起的作用更加重要。但到目前為止，人們對(duì)于CRP 在魚類免疫過程中的作用以及魚類CRP 基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制了解不夠深入，相關(guān)的研究報(bào)道也很少。唐春華等[12]采用RACE 方法克隆了CRP 基因全長cDNA，并利用RT–PCR 半定量法對(duì)健康及被嗜水產(chǎn)氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)人工感染的草魚的不同組織 CRP 的mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示CRP 基因在草魚的心臟、腦、前腸、腎臟、肝胰臟、肌肉、脾等組織中均有表達(dá)，表達(dá)水平差異不明顯。但在人工感染24 h 后，各組織中CRP 的mRNA 水平均有顯著升高，與哺乳動(dòng)物和一些魚類在炎癥反應(yīng)中血清CRP 水平升高一致，表明CRP 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是可誘導(dǎo)的?；蛏嫌握{(diào)控序列包含的啟動(dòng)子是基因的組成部分，控制基因表達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。有研究[13]表明，不同物種的相同基因在啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)上存在的差異，可能直接影響基因的轉(zhuǎn)錄活性，因此，鑒定草魚CRP 基因的上游調(diào)控序列，是研究上游調(diào)控序列在CRP 基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)調(diào)控過程中的作用，探討CRP 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的模式的前提。

1 材料與方法

1.1 供試草魚

Ⅰ齡草魚成魚購自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，平均體長(20 ± 2) cm，平均體質(zhì)量(112 ± 11) g。

1.2 試 劑

基因組DNA 提取試劑盒、Genome Walker 試劑盒購自大連寶生物公司；Advantage? 2 PCR 試劑盒購自Clontech 公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自Qiagene 公司；1 kb Plus DNA Ladder 購自BIONOVAS Biotechnology 公司；MarkerⅢ DNA Ladder 購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 草魚肝臟基因組DNA 的提取

取20 mg 新鮮草魚肝臟組織，剪成碎塊后用基因組DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，并進(jìn)行電泳檢測。

1.3.2 草魚CRP 基因上游序列擴(kuò)增

按照Genome Walker 試劑盒說明，根據(jù)CRP基因的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物：SP1(5′–GGAAAC AGAAGTACTTTACC–3′)用 于 第1 輪 擴(kuò) 增，SP2 (5′–CAAGACCCACTTCAGCAGCC–3′)用于第2輪擴(kuò) 增，SP3(5′–CCAGCATCTTGCTGCAGGTG–3′)用于第3輪擴(kuò)增。擴(kuò)增方法參照試劑盒說明，根據(jù)引物的退火溫度對(duì)PCR條件稍作修改：第1輪PCR程序?yàn)椋?2 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃預(yù)變性1 min；5個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min)，1個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，25 ℃退火3 min，72 ℃延伸2 min)，10個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，44 ℃退火1 min，72 ℃延伸2.5 min)，15個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸2.5 min)，1個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，44 ℃退火1 min，72 ℃延伸2.5 min)；72 ℃延伸5 min。第2輪PCR程序?yàn)椋?2 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃預(yù)變性1 min，15個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸2.5 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸2.5 min，94 ℃變性30 s，44 ℃退火1 min，72 ℃延伸2.5 min)。第3輪PCR程序與第2輪相同。3輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，用于瓊脂糖凝膠電泳分析，并將PCR目的條帶回收純化后送生工生物工程(上海)股份公司測序。

1.3.3 序列分析

將測序結(jié)果整理后利用在線啟動(dòng)子預(yù)測軟件PLACE(http://www.Dna.affrc.go.jp/PLACE/signalsca n.html)和 BDGP(http://www.fruitf ly.org/seq_tools/ promoter.html)分析CRP 上游調(diào)控序列中的核心啟動(dòng)子各組成部分以及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRP 基因上游序列Genome Walker 擴(kuò)增結(jié)果

利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析草魚肝臟基因組DNA(圖1)，DNA條帶清晰，無明顯降解。Genome Walker擴(kuò)增結(jié)果電泳分析(圖2)表明，第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多個(gè)條帶，而第2輪PCR出現(xiàn)條帶相對(duì)較少，第3輪PCR得到1條長度約稍大于1 000 bp的清晰條帶。目的條帶在3輪PCR中長度依次變小，這是由于巢式PCR中后一輪PCR的產(chǎn)物比前一輪要小。將第3輪PCR產(chǎn)物回收純化后送測序，得到長度為1 055 bp的序列。

圖1 草魚基因組DNA 電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis of Genomic DNA from grass carp (Ctenopharyngodon idellus)

圖2 Genome Walker 擴(kuò)增草魚CRP 基因上游序列Fig. 2 Up–stream sequence of CRP gene from grass carp (Cteno- pharyngodon idellus) amplified by Genome Walker

2.2 序列分析

將測序得到的序列與CRP全長cDNA序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其中僅包括57 bp的CRP 5′–UTR序列，其余部分均為非轉(zhuǎn)錄的上游序列。啟動(dòng)子元件和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果(圖3)顯示，在CRP上游序列中起始子序列為“TCAGATC”與草魚CRP保守起始子序列(PyPyA+1NT/A PyPy)[14]一致，其中的G為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在–41～ –35 bp處發(fā)現(xiàn)高度保守的RNA聚合酶II的結(jié)合位點(diǎn)TATAA–box；在–54～ –5 bp處發(fā)現(xiàn)1個(gè)高度保守的核心啟動(dòng)子序列；在–94～–91 bp處發(fā)現(xiàn)1個(gè)CAAT–box。此外，還發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括4個(gè)E–box元件(CANNTG)，其位置分別在–924～ –919 bp、–438～ –433 bp、–349～ –344 bp、–202～ –197 bp；3 個(gè)GT1 共 有 序 列(GT1 consensus，GRWAAW)，分別位于–606～ –601 bp，–594～ –589 bp，–131～ –126 bp；2個(gè)GT1–core元件(GGTTAA)，分別位于–391～ –386 bp，–268～ –263 bp；2個(gè)I–box–core元件(GATAA)，分別位于–606～ –602 bp，–142～ –138 bp。

圖3 草魚CRP基因上游調(diào)控序列分析Fig. 3 Analysis of up–stream regulatory sequence of CRP

3 討 論

Genome Walker方法是利用已知序列(如cDNA ) 從基因組中獲得基因的上游(如啟動(dòng)子) 或下游序列的方法[15]。由于基因組DNA 較復(fù)雜，如果在PCR反應(yīng)的最初階段退火溫度較低，容易造成非特異性擴(kuò)增。Genome Walker 先采用較高退火溫度，再采用較低退火溫度的擴(kuò)增方式，稱為降落PCR，在此PCR 的最初幾個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增效率不高，但擴(kuò)增的特異性較高，從而積累特異性PCR 產(chǎn)物，隨后通過降低退火溫度而提高擴(kuò)增的效率。本研究用Genome Walker 法，經(jīng)3 輪巢式PCR 擴(kuò)增CRP 上游序列，確保了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

和哺乳動(dòng)物一樣，魚類CRP基因的表達(dá)是可誘導(dǎo)的。在正常情況下，CRP以較低水平表達(dá)(組成型表達(dá))，這種表達(dá)主要是由遺傳因素決定的。當(dāng)魚類受到病原體的感染或其他誘導(dǎo)物刺激時(shí)，血清中CRP的水平可以在24～48 h內(nèi)迅速升高，如用嗜水產(chǎn)氣單胞菌可以誘導(dǎo)鯉魚血清CRP 水平升高[16]，用重金屬鎘可以誘導(dǎo)鯉科魚類的CRP表達(dá)升高[17]。類似的研究在斑馬魚[18]和虹鱒[19–20]中也有報(bào)道，其CRP表達(dá)升高的調(diào)控主要是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。真核生物轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，主要是通過一些反式調(diào)控因子與位于基因上游的一些順式調(diào)控元素結(jié)合，從而提高轉(zhuǎn)錄起始頻率來實(shí)現(xiàn)的。Szalai 等[21–22]的研究表明，人類CRP基因的內(nèi)含子區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域中的一些重復(fù)出現(xiàn)的二核苷酸能影響CRP的基礎(chǔ)表達(dá)。最近的研究表明，人類CRP基因3′端非翻譯區(qū)域和外顯子2中核苷酸的多態(tài)性也能影響CRP的組成型表達(dá)[23]，但這些不是主要的調(diào)控模式。通過對(duì)草魚CRP基因上游序列的分析可以看出，除了含有TATA–box、CAAT–box這些真核生物中基因組成型表達(dá)啟動(dòng)子所必須的序列以外，還含有大量的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括E–Box元件、GT1共有序列、GT1核心序列、I–box核心序列等。這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于CRP基因受到誘導(dǎo)后的高水平表達(dá)具有十分重要的作用。Stalberg等[24]將具有誘導(dǎo)調(diào)控作用的基因上游序列中重復(fù)出現(xiàn)的E–box突變以后，其可以導(dǎo)致所控制的基因的轉(zhuǎn)錄明顯降低，意味著這些E–box可能通過和某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。而GT1共有序列、GT1–core元件、I–box–core元件則都是誘導(dǎo)調(diào)控的必要元件，如GT1能通過與DNA的結(jié)合后經(jīng)GT1與TFIIA的相互作用，穩(wěn)定TFIIA–TBP–DNA (TATA box) 復(fù)合體，從而提高轉(zhuǎn)錄效率[25]，而I–box核心序列則是存在于很多光誘導(dǎo)表達(dá)的植物基因的上游序列中的保守序列[26]。

由于本次擴(kuò)增獲得的上游調(diào)控序列只有1 055 bp 左右，或許還有其他一些順式作用元件位于更遠(yuǎn)的上游，這些元件可能在草魚CRP基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)調(diào)控中同樣重要。本研究所獲得的上游序列，可經(jīng)引入報(bào)告基因和缺失突變，從細(xì)胞水平確定所預(yù)測的順式作用元件的功能。

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