蔡如繁，茹巧美，何晉浙

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院食品系,杭州310014)

0 引 言

乳制品是一種營養(yǎng)豐富，老少皆宜的產(chǎn)品，在我們的生活中不可或缺。自三聚氰胺事件之后，國家對于乳制品的安全問題格外重視。近來，衛(wèi)生部發(fā)布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》，公布一種乳制品非法保鮮劑，即硫氰酸鈉。硫氰酸鈉在牛奶或奶粉中摻入后可有效抑菌、保鮮。但硫氰酸鈉是毒害品，一般用于工業(yè)制造，人體少量的食入就會造成極大傷害。而且，目前尚無食品中硫氰酸鈉檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[1]，是乳品質(zhì)量安全的一大漏洞。因此，建立乳品非法保鮮劑的檢測分析方法，并對市場上常見品牌的乳品進(jìn)行風(fēng)險評估研究，對我國的奶業(yè)發(fā)展和人民身體健康具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

V-1800 PC型紫外分光光度計，Agilent 1260 Infinity高效液相色譜系統(tǒng)，ICS-2000離子色譜系統(tǒng)，配備電導(dǎo)檢測器，高速冷凍離心機(jī)，KQ5200ZE型數(shù)按超聲波清洗器，METTLER AE240電子分析天平，Millipore超純水發(fā)生器，RP柱。

1.2 原料與試劑

市售6種牛奶與6種奶粉品牌。

硫氰酸鈉儲備液(質(zhì)量濃度1 000 mg/L)：準(zhǔn)確稱取0.1 g硫氰酸鈉 (精確到0.0001)用純水定容到100 mL；硫氰酸鈉工作液：用純水將硫氰酸鈉儲備液逐級稀釋得到。

硝酸鐵溶液(質(zhì)量濃度50 g/L)：稱取25 g Fe(NO3)·9H2O溶于200 mL水中，加入25 mL濃硝酸，用水定容到1 000 mL的容量瓶中；Triton-X-100溶液 (200 g/L)：稱取20 g Triton-X-100，用水定容到100 mL的容量瓶中。

乙腈(色譜純)；

濃度為0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7)：稱取3.5814 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)溶于500 mL容量瓶，1.5601 g磷酸二氫鈉 (NaH2PO4·2H2O) 溶于500 mL容量瓶，再將磷酸氫二鈉∶磷酸二氫鈉=500∶320按比例混勻，制的磷酸鹽緩沖液。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5.0 g奶粉或吸取5.0 mL牛奶于50 mL的具塞比色管，加入15 mL水，密塞振搖均勻，在70℃下超聲提取10 min，冷卻后加入25 mL乙腈[2]，再超聲20 min，最后用水定容到50 mL。然后至高速冷凍離心機(jī)中，4℃下15 000 r/min離心20 min，小心取出全部上清液，過0.45 μm的有機(jī)濾膜，待測。

1.3.2 紫外分光光度法

吸取5 mL經(jīng)過前處理的奶粉樣品濾液，加入4 mL硝酸鐵溶液和4 mL Triton-X-100溶液，用水定容到25 mL，搖勻，暗處放置2 min后在465 nm下測定吸光值，以樣品空白做參比。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得樣品中的硫氰酸鈉質(zhì)量濃度[3]。另外，分光光度法不適合液奶的檢測。

1.3.3 液相色譜法

色譜柱：AgilentEclipseXDB-C18(4.6mm×150mm，5 μm)；流動相為磷酸鹽緩沖液∶乙腈=95∶5；流速為1 mL/min；紫外檢測波長為218 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL。

在上述色譜條件下，對標(biāo)準(zhǔn)工作液、樣品溶液、空白溶液分別進(jìn)樣測定，樣品濾液上機(jī)前要過0.22 μm的針式濾膜。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得樣品中硫氰酸鈉的質(zhì)量濃度。

1.3.4 離子色譜法

色譜柱：IonPac AS19分析柱 (4 mm×250 mm)和AG19保護(hù)住(4 mm×50 mm)；流動相：KOH溶液(由淋洗液發(fā)生器生成)，濃度為50 mmol/L等度淋洗；流速為1.00 mL/min；抑制電導(dǎo)檢測器：ASRS-300(4 mm)型抑制器，抑制電流 124 mA；柱溫為30℃；電導(dǎo)池溫度為35℃；進(jìn)樣量為25 μL。

經(jīng)過前處理的樣品溶液還要經(jīng)過OnGuard RP柱(RP柱活化：用 5 mL甲醇沖洗，再用10 mL去離子水沖洗，放置20 min)[4]，棄去前面流出的1/3體積，收集余下的流出液，再進(jìn)樣檢測。

在上述色譜條件下，對標(biāo)準(zhǔn)工作液、樣品溶液進(jìn)樣測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得樣品中硫氰酸鈉的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光光度法

2.1.1 顯色劑用量的確定

硫氰酸鈉能與三價鐵離子發(fā)生反應(yīng)，生成硫氰酸鐵絡(luò)合離子[5]。試驗初期采用硫酸鐵氨作為顯色劑，但是硫酸鐵氨不穩(wěn)定，而且硫酸鐵氨本底顏色較深。硝酸鐵本底顏色淺，可作為顯色劑使用，但顯色劑的加入量對顯色效果有明顯的影響，見表1。

表1 不同顯色劑用量對吸光值的影響

由表1可以看出，吸光值隨著顯色劑加入量的增大而增大，在顯色劑用量為4 mL的時候，曲線的斜率較大，之后趨于平緩，所以本試驗選用顯色劑的加入量為4 mL。

2.1.2 穩(wěn)定劑用量的確定

在檢測過程中發(fā)現(xiàn)，樣品的吸光值會隨著時間變化呈下降趨勢，可能是由于生成的硫氰酸鐵顏色不穩(wěn)定，因此使用Triton-X-100溶液作為顯色穩(wěn)定劑，而穩(wěn)定劑的用量對實驗結(jié)果也有明顯的影響，見表2。

表2 不同穩(wěn)定劑用量對吸光值的影響

由表2可以看出，分別在5，30和60 min測量吸光值，當(dāng)Triton-X-100溶液加入量為4 mL的時候，吸光值變化最小，越靠近4 mL變化也越小。因此選擇穩(wěn)定劑的加入量為4 mL。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取硫氰酸鈉工作液(質(zhì)量濃度100 mg/L)0，0.25，0.5，0.75，1.0 mL于50 mL的容量瓶中， 加入4 mL硝酸鐵溶液，再加入4 mL的Triton-X-100溶液，最后用純水定容，搖勻。暗處放置2 min，以零號管試劑空白做參比，在465 nm下測定吸光度。以吸光度(Y)對硫氰酸鈉濃度(x)得到線性回歸方程Y=0.0386x+0.0002,R2=0.9995，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

2.1.4 檢測限、精密度與回收率測量

按上述方法，對空白溶液連續(xù)進(jìn)行11次測量，求出其標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.10，以3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差得出本方法的最低檢測限(LOD)為0.3 mg/L。

對質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行7次重復(fù)測量，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.70%。

為了研究檢測方法的可靠性，對空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗。稱取空白樣品各5 g，然后分別加入質(zhì)量濃度為100 mg/L硫氰酸鈉工作液0.75，2.5，5 mL，按上述前處理方法處理，然后進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，回收率可達(dá)99.05%～107.5%，實驗結(jié)果如表3所示。

表3 硫氰酸鈉加標(biāo)回收檢測結(jié)果

2.2 液相色譜法

2.2.1 流動相的選擇

硫氰酸鈉在水中電離成硫氰酸根離子，而硫氰酸根是帶電的強極性物質(zhì)。試驗初期采用磷酸-三乙胺組成的緩沖液體系[6]，但效果不是很理想，保留時間會發(fā)生偏移。后來采用磷酸鹽緩沖液(pH=7)，同時采用乙腈作為有機(jī)相[7]，取得較好的峰型和系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)。

2.2.2 色譜柱的選擇

對于色譜柱的選擇，選用了Agilent Eclipse XDBC18柱和Trigerkin ODS3柱進(jìn)行比較。硫氰酸根在ODS柱的出峰時間為3.58 min，在C18柱的出峰時間為1.75 min。但采用ODS柱的標(biāo)準(zhǔn)溶液在出峰后會有一個向下的趨勢，而C18柱峰型良好，因此選用C18色譜柱，典型奶粉樣品圖見圖2。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取硫氰酸鈉儲備液，逐級稀釋得到質(zhì)量濃度為100，50，10，5，1 mg/L的硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后在上述色譜條件下上機(jī)測定，每個質(zhì)量濃度測定3次，記錄色譜峰面積均值，以峰面積(A)對標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度(C)得到線性回歸方程，A=16.153C+1.9812，R2=0.9999。結(jié)果表明，該方法進(jìn)樣質(zhì)量濃度在1～100 mg/L范圍內(nèi)線性良好。質(zhì)量濃度10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜圖如圖3所示。

2.2.4 檢測限、精密度與回收率測量

在上述色譜條件下，對空白溶液連續(xù)進(jìn)行11次測量，求出其標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.063，以3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差得出最低檢出限(LOD)為0.2 mg/L。

對質(zhì)量濃度為5 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行7次重復(fù)測量，得出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.31%。

為了研究方法的可靠性，對空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗。分別在空白樣品中添加5 mL質(zhì)量濃度為3，5，10，50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)過前處理后，按上述色譜條件進(jìn)行檢測，回收率達(dá)到83%～99.06%，結(jié)果如表4所示。

表4 硫氰酸鈉加標(biāo)回收檢測結(jié)果

2.3 離子色譜法

2.3.1 色譜柱的選擇

硫氰酸根是疏水性較強的陰離子，在普通的陰離子柱上保留時間長、易拖尾且會出現(xiàn)峰型不對稱的情況，因此需要選擇親水性強的陰離子色譜柱。本研究將IonPac AS16、SH-Anion-1和IonPac AS19陰離子色譜柱進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)IonPac AS19對于硫氰酸根分離時間短、峰型對稱且分離度高，效果非常理想。

2.3.2 淋洗液濃度的選擇

由于硫氰酸根屬于疏水性陰離子，因此在色譜柱上保留時間較長，一般情況下需要濃度較高且洗脫能力較強的淋洗液進(jìn)行淋洗。固定流速對淋洗液的濃度進(jìn)行考究，發(fā)現(xiàn)隨著淋洗液濃度的增大，硫氰酸鈉保留時間縮短，且峰型拖尾狀況得到改善。當(dāng)設(shè)定淋洗液濃度為30 mmol/L的時候，出峰時間約為25 min，當(dāng)淋洗液濃度增大到50 mmol/L的時候，出峰時間提前到約11 min，且峰型良好，典型奶粉樣品圖見圖4，因此選用50 mmol/L的KOH進(jìn)行等度淋洗[8]。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將硫氰酸鈉儲備液逐級稀釋得到2，1.5，1，0.5，0.1，0.05 mg/L的硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液，在上述色譜條件下直接上機(jī)測定，每個濃度測定3次，記錄色譜峰面積均值，以峰面積(A)對標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度(ρ)得到線性回歸方程，A=0.0615ρ-0.0003，R2=0.9999。 結(jié)果表明，該方法進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.05～2 mg/L范圍內(nèi)線性良好。質(zhì)量濃度1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜如圖5所示。

2.3.4 測量結(jié)果

在上述色譜條件下，將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以3倍信噪比(S/N=3)計算，得出最低檢測限為0.05 mg/L。

對質(zhì)量濃度0.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行7次重復(fù)測量，得出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.615%。

同樣對空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗。在空白樣品中添加5mL質(zhì)量濃度為1，5，10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)過前處理后，按上述色譜條件進(jìn)行檢測，回收率達(dá)到81.7%～99.13%，結(jié)果如表5所示。

表5 硫氰酸鈉加標(biāo)回收檢測結(jié)果

2.4 樣品檢測比較與討論

采用本文三個方法對市場上不同品牌的6個奶粉樣品和6個液奶樣品進(jìn)行檢測，每個樣品重復(fù)三次，取平均值。其測定結(jié)果相近且樣品加標(biāo)回收實驗結(jié)果理想，典型奶粉樣品的加標(biāo)結(jié)果如表6所示。

表6 典型奶粉樣品加標(biāo)結(jié)果對比

結(jié)果表明，紫外分光光度法的檢測限為0.3 mg/L，當(dāng)加標(biāo)量為0.3 mg/L時，空白回收率可達(dá)到102.6%；當(dāng)加標(biāo)量為1 mg/L時，空白回收率為107.5%，但樣品加標(biāo)回收率只有95.31%。說明低質(zhì)量濃度檢測時紫外分光光度法對樣品結(jié)果干擾較大，不適合質(zhì)量濃度太低的樣品檢測，而且紫外分光光度法由于在樣品分析過程中會出現(xiàn)渾濁情況影響實驗結(jié)果，所以不適用于液奶的測定，對于奶粉測定結(jié)果良好。

液相色譜法的檢測限為0.2 mg/L，當(dāng)加標(biāo)量為0.3 mg/L時，空白回收率僅為80.33%，當(dāng)加標(biāo)量為1 mg/L時，空白回收率達(dá)到97.69%，樣品加標(biāo)回收率為102.15%，當(dāng)加標(biāo)量為5 mg/L時，空白回收率達(dá)到99.06%。

離子色譜法的檢測限為0.05 mg/L，當(dāng)加標(biāo)量為0.1 mg/L時，空白回收率僅僅只有81.7%，當(dāng)加標(biāo)量為1 mg/L時，空白回收率達(dá)到99.13%，樣品回收率可達(dá)到101.1%。液相色譜和離子色譜對于樣品檢測結(jié)果干擾都比較小，而離子色譜更適合于低濃度樣品檢測。

因此，各個方法都具有良好的適用性和實用性，可以根據(jù)不同的需求加以選擇。另外，由于環(huán)境污染等原因，乳制品中會含有痕量硫氰酸根本底，其含量因品種、個體、環(huán)境等因素而存在差異[9]。因此，選用有品牌保證的乳制品將降低硫氰酸鈉攝入污染的風(fēng)險。

3 結(jié) 論

本文建立了奶粉和牛奶中硫氰酸鈉的分析檢測方法，重點比較了分光光度法、液相色譜法和離子色譜法對于檢測乳品中硫氰酸鈉的檢測限、精密度以及回收率。

結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度的回收率要低一些，因此對硫氰酸鈉的分析結(jié)果相對誤差要大一些。紫外分光光度法僅適合奶粉的檢測，但不適合低濃度奶粉樣品的檢測，相對來說誤差要大。而液相色譜和離子色譜對于樣品檢測干擾較小，且離子色譜對于低濃度的樣品檢測結(jié)果更加可靠。

因此，對于一些資金少、儀器操作人員不夠?qū)I(yè)的小型奶粉企業(yè)可以采用紫外分光光度法，此設(shè)備價格合理，而且操作簡單、實驗時間短，很適合在各奶粉制品企業(yè)推廣；液相色譜法檢測限低，應(yīng)用范圍廣泛，適用于實驗室以及檢測單位；離子色譜法檢測限更低，儀器更加靈敏，但設(shè)備也比較昂貴，推廣范圍不是很廣，因此主要適用于各個研究院以及檢測單位的微量物質(zhì)檢測。

[1]GB2760-2011,食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

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