呂汕群 姚婷婷* 黃諾潔 莊 敏

（1 汕頭市中心醫(yī)院婦產科，廣東 汕頭 515031；2 中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院婦產科，廣東 廣州 510120）

mTOR和PTEN在宮頸鱗癌中的表達及意義

呂汕群1姚婷婷2* 黃諾潔1莊 敏1

（1 汕頭市中心醫(yī)院婦產科，廣東 汕頭 515031；2 中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院婦產科，廣東 廣州 510120）

目的 PI3 K/PTEN/AKT/mTOR信號傳導通路具有重要的細胞調節(jié)功能，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展也發(fā)揮著重要的作用。但目前宮頸鱗癌中該通路的研究尚不充分。本研究擬檢測不同宮頸病變組織中mTOR和PTEN 蛋白的表達,探討該信號轉導途徑與宮頸鱗癌生物學行為的關系。方法采用免疫組化SP法檢測宮頸鱗癌70例、正常宮頸組織20例中mTOR和PTEN的表達情況，并分析與宮頸癌臨床病理因素的關系。結果mTOR蛋白在正常宮頸組織中陽性表達率為5%,顯著低于宮頸鱗癌組織85.7%（P＜0.01）。PTEN蛋白在正常宮頸組織陽性表達率為100.0%，顯著高于宮頸鱗癌組織70.0%（P＜0.01）。mTOR蛋白的表達與宮頸鱗癌患者臨床分期有關（P＜0.05），與病理分級、淋巴轉移無關（P＞0.05）。PTEN蛋白的表達與宮頸鱗癌患者臨床分期、病理分級、淋巴轉移無關。宮頸鱗癌組織中隨著mTOR表達的增強，PTEN表達的陽性率降低。二者呈負相關（P＜0.01）。結論mTOR蛋白的高表達和PTEN蛋白的低表達對宮頸鱗癌細胞的增殖、浸潤和轉移有一定的生物學意義。

宮頸鱗癌；雷帕霉素靶蛋白；第10染色體同源丟失磷酸酶-張力蛋白基因；免疫組織化學

宮頸癌是全球婦女第二高發(fā)惡性腫瘤，僅次于乳腺癌，在發(fā)展中國家其發(fā)病率居第一位。近年來，宮頸癌的發(fā)病率有明顯上升趨勢，尤其是年輕宮頸癌病人。宮頸癌中80%是鱗癌。其病因及發(fā)病機制至今不明。在惡性腫瘤細胞的增殖、分化過程中，PI3 K/AKT/PTEN/ mTOR信號轉導通路起著重要的作用。而在這條信號轉導通路中，PTEN作為一種具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，在人類許多腫瘤和遺傳性腫瘤易感綜合征中均存在突變或缺失。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，與蛋白的轉錄與翻譯關系密切。它們在該信號轉導通路中起重要調節(jié)作用，最終調控細胞周期和細胞凋亡[1]。本研究采用免疫組化SP法檢測宮頸鱗癌70例、正常宮頸組織20例中PTEN的表達水平，結合臨床病例的分期、腫瘤分級、淋巴結是否轉移進行統(tǒng)計學分析來探討PTEN在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本制定

20例正常宮頸組織、70例宮頸鱗癌組織經10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚4μm。切片貼在涂有防脫膠的載玻片上，脫蠟至水，切片在作免疫組化染色前先作組織抗原高溫高壓修復。組織抗原修復主要步驟：將pH值=6.0檸檬酸鹽緩沖液置于壓力鍋加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片放入沸騰的緩沖液中，高壓鍋噴氣持續(xù)1～2min，冷卻至室溫后取出切片，蒸餾水沖洗3次。

1.2 主要試劑

兔抗人PTEN多克隆抗體，S-P試劑盒均為福州邁新生物技術開發(fā)公司產品?？贵w工作濃度為1∶50，陰性對照以PBS替代一抗；用已知陽性標本作陽性對照。兔抗mTOR單克隆抗體（克隆號bs-1992R）購于北京博奧森公司。

1.3 實驗方法

免疫組化染色采用S-P法，具體實驗操作步驟如下：①抗原修復后的組織切片用PBS沖洗，5min×3次；②3%過氧化氫甲醇溶液，孵育10min；③PBS沖洗，5min×3次；④每張切片加50mL非免疫性動物血清，室溫下孵育10min后吸去多余的液體；⑤每張切片加50mL的笫一抗體，置于4℃冰箱過夜；⑥PBS沖洗，5min×3次；⑦每張切片加50mL生物素標記的笫二抗體，室溫下孵育10min；⑧PBS沖洗，5min ×3次；⑨每張切片加50ml鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10min；⑩PBS沖洗，5min×3次；⑾DAB顯色；⑿蘇木素復染，中性樹膠封固。用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判斷

表1 mTOR和PTEN在正常宮頸組織和宮頸鱗癌組織中的表達

表2 mTOR 和PTEN表達與宮頸鱗癌臨床病理指標的關系

細胞核/漿著色為陽性反應。著色評分標準：不著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。每張切片觀察500個細胞數(shù)，陽性細胞所占比例評分標準：≤5%者0分，6%～25%者1分，26%～50%者2分，＞50%者3分。染色強度評分與陽性細胞評分相加：≤1分為陰性，＞1為陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1 mTOR和PTEN在正常宮頸組織和宮頸鱗癌組織中表達情況

mTOR和PTEN表達于正常宮頸上皮細胞和宮頸鱗癌細胞的胞質和胞膜，偶見胞核和少量間質著色，鏡下可見胞質及胞膜中棕黃色顆粒均勻分布或粗細不等散在分布。mTOR蛋白在正常宮頸組織中表達的陽性率低于宮頸鱗癌組織中表達的陽性率,差異具有顯著性（圖1-1、圖1-2，P＜0.01）。PTEN蛋白在正常宮頸組織中表達的陽性率高于宮頸鱗癌組織中表達的陽性率，差異具有顯著性（圖2-1、圖2-2，P＜0.01）。見表1。

圖1 -1 mTOR 在正常宮頸組織中的表達（×400） 圖1-2 mTOR 在宮頸鱗癌組織中的表達（×400）

圖2 -1 PTEN 在正常宮頸組織中的表達（×400） 圖2-2 PTEN 在宮頸鱗癌組織中的表達（×400）

2.2 mTOR和PTEN的表達與宮頸鱗癌各臨床病理因素的關系

宮頸鱗癌中mTOR表達的陽性率與臨床分期有關（P＜0.01），與淋巴轉移、病理分級無關（P＞0.05）。結果中也可見PTEN表達的陽性率與這幾種病理因素都無關（P＞0.05），見表2。

2.3 宮頸鱗癌中mTOR和PTEN二者表達的相關性

70例宮頸鱗癌組織中mTOR表達陽性60例，陰性10例。在mTOR表達陽性的組織中PTEN陽性48例，mTOR表達陰性的組織中PTEN陽性1例。PTEN在mTOR陽性組織中的陽性率明顯低于在mTOR陰性組織中的陽性率（P＜0.01）。二者的表達成呈顯著負相關（P＜0.01）。PTEN的陽性率隨mTOR表達陽性的遞減。見表3。

表3 mTOR 和PTEN表達的相關性

3 討 論

雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，從酵母到哺乳動物其廣泛存在，且進化十分保守。mTOR是1991年HEITMAN等在分析不同啤酒酵母突變體對雷帕霉素抵抗作用的差別時發(fā)現(xiàn)的[1]。mTOR屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶（phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase，PIKK）蛋白家族，在調節(jié)細胞生長、增殖、調控細胞周期等多個方面起到重要作用，是腫瘤治療的一個重要靶點。

PTEN是第10染色體同源丟失磷酸酶-張力蛋白基因，又名MMACI，是1997年發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因，是迄今發(fā)現(xiàn)的第一具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，可通過基因突變、DNA甲基化等方式失活，主要表現(xiàn)為基因缺失、蛋白表達減少[2-3]。PTEN定位于人類染色體10q23.3上，含9個外顯子，8個內含子。cDNA序列包含由1209個核苷酸組成的開放閱讀框架，編碼403個氨基酸組成的蛋白質[4-5]。PTEN基因的突變或缺失導致磷酸酶活性喪失，失去了對細胞增殖的負調控作用，誘導細胞持續(xù)增殖，使細胞發(fā)生惡性轉化。

PI3K/AKT/PTEN/mTOR信號轉導通路主要有以下功能：①調控細胞周期，誘導細胞凋亡。②參與腫瘤血管形成。③參與腫瘤細胞的轉移和侵襲。mTOR和PTEN是PI3 K/AKT/PTEN/mTOR信號轉導通路重要靶點。肺癌、膠質瘤、前列腺癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)其異常表達[6-8]。

在本研究中mTOR與宮頸癌的發(fā)生有關，且在宮頸癌發(fā)生的早期即存在，提示mTOR可為宮頸癌的早期診斷、治療提供一定的幫助。PTEN在宮頸鱗癌組織、正常宮頸組織表達差異有統(tǒng)計學差異，這可能是由于PTEN蛋白的功能缺失使其對腫瘤細胞生長抑制及對細胞黏附的控制減弱，有助于宮頸癌的發(fā)生。

mTOR、PTEN基因有可能作為早期篩查宮頸癌的指標應用于臨床，來篩查宮頸癌的高危人群，為宮頸癌的早期診斷提供幫助。

[1] Haas-kogan D,Shalev N,Wong M,et al.Protein Kinase B(PKB/ Akt) activity is elevated in glioblastoma cells due tomutation of the tumor suppressor PTEN/MMAC[J].Curr Biol,1998,8(21):1195-1198.

[2] Hriai Y,Tanaka N,Furuta R,et al.Somatic mutations of the PTEN/ MMAC1 gene associated with frquent chromosomal loss detected using comparative genomic hybridiz ation in endometrial cancer [J]. Gynecol Onocol,2001,83(1):81-83.

[3] Nakako S,Hajime T,Masato N.Loss of heterozygosity on 10q23.3 and mutation of the tumor suppressor gene PTEN in beningn endometrial cyst of the ovary: Possible sequence progression from bengin endometrial cyst to endometrial carcinoma and clear cell carcinoma of ovary[J].Cancer Res, 2000,60(18):7052-7056.

[4] Comes CP,Andrade LA.PTEN and p53 expression in primary ovarian carcinomas: immunohistochemical study and discussion of pathogenetic mechanisms[J].Int J Gynecol Cancer, 2006,16(Suppl 1): 254-258.

[5] Hashiguchi Y,Tsuda H,Lnoue T,et al.PTEN expression in clear cell adenocarcinoma of the ovary[J]. Gynecol Oncol,2006,101(1):71-75.

[6] Panagiotou I,Tsiambas E,Lazaris AC,et al.PTEN expression in non small cell lung carcinoma based on digitized image analysis [J].J BUON,2012,17(4):719-723.

[7] Moon SH,Kim DK,Cha Y,et al.PI3K/Akt and Stat3 signaling regulated by PTEN control of the cancer stem cell population,proliferation and senescence in a glioblastoma cell line[J].Int J Oncol, 2013,42(3):921-928.

[8] Zhang W,Haines BB,Efferson C,et al.Evidence of mTOR Activation by an AKT-Independent Mechanism Provides Support for the Combined Treatment of PTEN-Deficient Prostate Tumors with mTOR and AKT Inhibitors[J].Transl Oncol,2012,5(6):422-429.

mTOR and PTEN in Cervical Squamous Cell Carcinoma and Its Significance

LV Shan-qun1, YAO Ting-ting2*, HUANG Nuo-jie1, ZHUANG Min1

(1 Department of Obstetrics and Gynecology, Shantou Central Hospital, Shantou 515031, China; 2 Department of Obstetrics and Gynecology, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, China)

ObjectiveThe expression of mTOR and PTEN in cervical cancer tissue and their function on occurrence and progress of cervical squamous cancer.MethodsThe expression of mTOR and PTEN in 70 specimens of cervical squamous carcinoma and 20 specimens of normal cervical epithelium were detected by SP immunohistochemistry. Their correlations were analyzed.ResultsThe expression of mTOR on cervical cancer was significantly higher than normal cervical(P＜0.01).The expression of mTOR was correlated with clinical stages（P＜0.01）,but there was no difference with regard to pathological grades and lymph node metastasis（P＞0.05）.The PTEN is lower expressed in cervical cancer tissue than in normal cervical tissue(P＜0.01).The PTEN expression has no relationship with staging,grading and lymphatic metastasis of cervical cancer. The expression of mTOR protein was positively correlated to the expression of PTEN protein.（P＜0.01）.ConclusionThe mTOR and PTEN protein associate with the occurrence of cervical cancer.

Cervical cancer;mTOR; PTEN;SP method

R737.33

B

1671-8194（2013）18-0001-03

國家自然青年基金編號81101979；廣東省自然博士啟動編號S2011040004639；廣東省醫(yī)學科研基金編號B2011088；中山大學青年教師基金；逸仙優(yōu)秀醫(yī)學人才基金

*通訊作者：E-mail：squall41269@21cn.com