鄭瑞生, 陳涼涼, 肖 熙

(1.泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,福建泉州 362002;2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

鮑魚營養(yǎng)豐富,味道鮮美,具有潤肺、滋腎補(bǔ)虛等功效,深受廣大消費(fèi)者喜愛.但是對于鮮鮑的烹飪并非人人都會,而將其加工成方便、快捷、安全的即食鮑魚既可以豐富鮑魚的產(chǎn)品品種,又可以滿足現(xiàn)代都市人的需求.但由于鮑魚加工過程受熱不均,殺菌不夠徹底,容易導(dǎo)致烘制后的鮑魚發(fā)生黑變、流汁、惡臭等現(xiàn)象,造成產(chǎn)品的腐敗變質(zhì),縮短產(chǎn)品的保質(zhì)期.有研究認(rèn)為大多數(shù)情況下食品中只有部分微生物參與腐敗過程[1].針對這種情況,在20世紀(jì)90年代中期Dalgaard明確提出了特定腐敗菌(specific spoilage organism,SSO)的概念[2-3].在剛加工完產(chǎn)品的微生物菌群中特定腐敗菌數(shù)量少,但這些特定腐敗菌在貯藏過程中生長較其他微生物快,并且腐敗活性增強(qiáng)[4].因此,研究熟制鮑魚產(chǎn)品中殘留的特定腐敗菌,對于有針對性的采取控制措施,防止其發(fā)生腐敗變質(zhì),保證產(chǎn)品的質(zhì)量安全具有十分重要的意義.食品中微生物的分離鑒定通常依賴于各種各樣的表型觀察.但由于有些表型不典型可能會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果[5].目前出現(xiàn)了許多基于分子生物學(xué)技術(shù)的快速而直接的檢測微生物的方法,其中細(xì)菌的序列分析是目前較好的新方法之一,16SrDNA分子大小適中,有足夠的遺傳信息用于分類研究,因此在許多細(xì)菌分離鑒定上被廣泛使用[6-7].

本文采用平板劃線分離方法,對烘制后的鮑魚中殘留的主要細(xì)菌菌群進(jìn)行分離,并通過菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色分析和16S rDNA序列比對的方法對其進(jìn)行鑒定.從而為烘制鮑魚加工過程中殘留腐敗菌的控制,延長產(chǎn)品貨架期提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗原料

鮑魚購于福州市水產(chǎn)品批發(fā)市場,重量在50 g左右的鮮活鮑魚,加冰條件下運(yùn)送至實驗室.將鮮活鮑魚進(jìn)行開殼、取肉,洗凈后選擇鮑體飽滿、大小一致、外膜透明、有鮑魚固有氣味的鮑魚,瀝水,放入超低溫冰箱中進(jìn)行單體快速凍結(jié).選取凍結(jié)后鮑魚進(jìn)行解凍、清洗、瀝干,用鋁盤盛后放入100℃烘箱中進(jìn)行烘制5 min,冷卻裝入無菌三角瓶中,并于24 h內(nèi)分析該加工后的鮑魚殘留菌情況.

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、葡萄糖、氯化鈉、普通營養(yǎng)瓊脂,均購于國藥集團(tuán);酵母提取物,上海生物工程有限公司;革蘭氏染色試劑盒,購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;d NTPs(4種脫氧核苷三磷酸)、10倍濃度的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)緩沖液(Mg2+Plus)、Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker均購于TaKaRa生物工程有限公司;Universal DNA Purification Kit,天根生化(北京)科技有限公司;Agarose 1-H,BBI生物科技有限公司;Agar A,波士頓生物技術(shù)(BBI)有限公司.溶菌酶(Lysozyme)(酶活＞22 800 U/mg)和蛋白酶K(Proteinase K)(酶活為30 U/mg)均購于BBI生物科技有限公司.

100 mmol/L Tris-HCl母液是取三羥甲基氨基甲烷(Tris(Hydroxymethyl)aminomethane,Tris)12.1 g,溶于去離子水中,再用100 mmol/L鹽酸調(diào)整pH值至8.0,定容至1 L,高壓121℃滅菌30 min后備用.

100 mmol/L EDTA母液是取乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)29.2 g,溶于去離子水中,再用100 mmol/L氫氧化鈉調(diào)整pH值至8.0,定容至1 L,高壓121℃滅菌30 min后備用.

TE溶液是取100 mL Tris-HCl母液和10 mL EDTA母液用去離子水定容至1 L,高壓121℃滅菌30 min后備用.

DNA提取緩沖液由100 mmol/L Tris-HCl母液(pH值8.0),100 mmol/L EDTA母液(pH值8.0),100 mmol/L磷酸鈉,1.5 mol/L NaCl,質(zhì)量濃度為1%的十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,HTAB)組成,高壓121℃滅菌30 min后備用.

1.2.2 主要儀器設(shè)備

AL-204型電子天平,特勒-托利多儀器(上海)有限公司;電熱干燥箱,上海實驗儀器總廠;CT-2000型高壓滅菌鍋,天津市超拓科貿(mào)有限公司;SW-CJ-1FB型超凈工作臺,蘇凈集團(tuán)安泰公司;GSP-9160MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱,海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HZQ-F型全溫振蕩培養(yǎng)箱,哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;電動勻漿機(jī),國華科技有限公司;Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡;AG22331型 PCR擴(kuò)增儀,德國 Eppendorf Hamburg公司;Tanon2500R型凝膠成像系統(tǒng),Tanon科技上海有限公司;紫外反射透射儀,上海精科實業(yè)有限公司;SDC-6型恒溫水浴鍋,波新芝生物科技股份有限公司;D-YY-12型電腦三恒多用電泳儀,北京六一儀器廠;Lx-100型手掌型離心機(jī),江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠;UB-7型酸度計,ENVER INSTRUMENT公司;微量移液器(10,100,200,1 000μL),德國Eppendorf Hamburg公司;GL-20G-H型冷凍離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;H1650-W型臺式高速離心機(jī),湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;ND-1000型核酸測定儀,美國Nano Drop公司.

2 實驗方法

2.1 主要殘留菌的分離純化與初步鑒定

取熟制后的鮑魚10 g,放入滅菌后的生理鹽水100 mL中,于20℃條件下進(jìn)行振蕩搖勻,至肉湯明顯混濁,取1 mL肉湯,用10倍遞增法進(jìn)一步制成1×10-2,1×10-3,1×10-4和1×10-5等體積分?jǐn)?shù)的稀釋液,取 100μL稀釋體積分?jǐn)?shù)為 1×10-3,1×10-4和1×10-5的稀釋液涂布營養(yǎng)瓊脂平板(含0.5%葡萄糖)進(jìn)行培養(yǎng),挑取菌落數(shù)在30～300個左右的平板,對典型的單菌落反復(fù)進(jìn)行劃線分離、純化.共篩選出52株,將分離純化后的單菌落放置于35℃培養(yǎng)箱中(該溫度條件下有利于嗜中溫性海洋細(xì)菌生長,同時可防止溫度過高導(dǎo)致培養(yǎng)基水分散失較多,邊緣發(fā)生干裂),培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落觀察,包括菌落的大小、形態(tài)、顏色、隆起度、邊緣結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)、光澤度、透明度及質(zhì)地等.同時挑取長勢好的單一菌落,對其進(jìn)行革蘭氏染色及芽孢染色,并在顯微鏡下觀察.

2.2 鮑魚殘留細(xì)菌的總DNA提取及PCR擴(kuò)增

2.2.1 鮑魚殘留細(xì)菌總DNA的提取

挑取經(jīng)分離純化后的菌樣數(shù)環(huán),置于20 mL滅菌后的營養(yǎng)肉湯中(含0.5%葡萄糖),于35℃條件下進(jìn)行振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)24 h,至菌液明顯混濁(說明微生物大量生長).取上述菌液1 mL,12 000 r/min室溫離心5 min,棄上清得菌體沉淀,再加入1 mL TE溶液,充分震蕩使菌體懸浮,加入200μL溶菌酶(10 mg/L)37℃水浴30 min,再加入3 mL DNA提取緩沖液和20μL蛋白酶K(20 mg/mL),混勻后于65℃下水浴1 h,期間每20 min中放入-80℃超低溫冰箱凍融10 min,重復(fù)3次.

凍融完畢后,加入等體積的Tris飽和酚-氯仿-異戊醇混合溶液(V(Tris飽和酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1),輕輕混勻,常溫 12 000 r/min 離心10 min,小心吸取上層溶液于另一離心管中,溶液再用等體積的氯仿-異戊醇混合溶液(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)抽提一次,之后加入0.6倍體積的預(yù)冷的異丙醇,4℃靜置沉淀1 h后,4℃ 12 000 r/min離心10 min,棄上清,沉淀用1 mL 70%的乙醇(含0.1 mol/L,醋酸鈉)重復(fù)洗滌2～3次,沉淀于超凈臺下吹干,以去除殘留的乙醇.最后沉淀溶解于50μL的TE中.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA完整性,并進(jìn)行DNA濃度的測定.

2.2.2 PCR擴(kuò)增

以2.2.1提取的 DNA作為模板,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增.

1) 反應(yīng)引物：引物 1(27F)：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′;引物 2(1492R)：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′.

2)反應(yīng)體系(50μL)：25μL的反應(yīng)體系中含有10倍PCR緩沖液(Mg2+Plus)2.5μL、dNTP(2.5 mmol/L)2.0μL、適度稀釋的模板DNA(約10 ng)1 μL、Taq酶(2.5 U/μL)0.4 μL、引物 1 和引物 2 各0.5μL(10 pmol/L)、重蒸水18.1μL.

3)反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min,94℃變性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸90 s,35個循環(huán)后,72℃延伸10 min.

2.2.3 PCR產(chǎn)物測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收純化,由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序.將拼接后的測序結(jié)果輸入 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast,利用BLAST軟件,將測定得到的基因序列與Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對分析,進(jìn)行同源相似性比較.

3 結(jié)果與討論

3.1 殘留細(xì)菌分離及染色結(jié)果

從熟制鮑魚中挑取具有典型菌落形態(tài)特征的殘留菌52株.根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色,及芽孢染色結(jié)果對其進(jìn)行初步分類,其中典型的主要殘留細(xì)菌有7株,其編號及菌落形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果、形態(tài)特征描述分別見圖1、圖2及表1.

3.2 16S r DNA基因同源性分析結(jié)果

3.2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

分別提取7株菌的基因組DNA后,利用PCR擴(kuò)增其16SrDNA基因片段,取PCR產(chǎn)物5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,如圖3.各樣品都在1 500 bp處出現(xiàn)明顯條帶,說明供試菌株的16S rDNA基因擴(kuò)增成功.

3.2.2 PCR產(chǎn)物測序及菌株鑒定

測定殘留細(xì)菌的16S rDNA全序列,分析其同源性,明確各種菌的種屬類別.將獲得的有效序列提交到NCBI,通過Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行相似性比對(http：∥ncbi.nlm.nih.gov/blast).PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,進(jìn)行核苷酸序列分析,結(jié)果見表2.

圖1 主要殘留菌平板菌落特征Fig.1 Characteristics of main residual bacteria colonies

圖2 主要殘留菌革蘭氏染色Fig.2 Gram staining of main residual bacteria

表1 主要殘留菌的形態(tài)特征Tab.1 Morphological characteristics of main residual bacteria

表2 主要殘留菌的鑒定結(jié)果Tab.2 Identification results of main residual bacteria

由表2可知,分離到的細(xì)菌序列與Genbank中最接近細(xì)菌的同源性達(dá)到99%,最終確定這些細(xì)菌分別為：希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、庫特氏桿菌屬(Kurthia sp.)、海洋類香菌(Myroides pelagicus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、腸桿菌屬(Enterobacter sp.)、彭氏變形桿菌(Proteus penneri)等,各自在殘留細(xì)菌中所占比例分別為21.15%(11株)、21.15%(11株)、17.31%(9株)、17.31%(9 株)、9.62%(5 株)、9.62%(5株)、3.85%(2株).由此可見,希瓦氏菌屬、不動桿菌屬是烘制鮑魚中主要的殘留細(xì)菌.

圖3 主要殘留菌的16SrDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretic graph of 16SrDNA amplified from main residual bacteria

4 結(jié) 論

本研究從烘制鮑魚中分離出的殘留細(xì)菌,經(jīng)過菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色以及16S rDNA序列分析后,鑒定其分別為希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、庫特氏桿菌屬(Kurthia sp.)、海洋類香菌(Myroides pelagicus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、腸桿菌屬(Enterobacter sp.)、彭氏變形桿菌(Proteus penneri)等,其在殘留的細(xì)菌中所占比例分別為21.15%,21.15%,17.31%,17.31%,9.62%,9.62%,3.85%.其中希瓦氏菌屬、不動桿菌屬、蠟樣芽孢桿菌、腸桿菌屬及彭氏變形桿菌為常見的腐敗菌,而庫特氏桿菌屬、海洋類香菌較為少見.希瓦氏菌屬、不動桿菌屬又是烘制鮑魚中主要的殘留細(xì)菌.

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