郝 林姜 波韓從輝龐 慧何厚光付 昱張俊杰張培影*

（1 徐州市中心醫(yī)院泌尿外科，江蘇 徐州 221009；2 徐州市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221009）

苦瓜MAP30基因克隆與鑒定

郝 林1姜 波1韓從輝1龐 慧2何厚光1付 昱2張俊杰1張培影1*

（1 徐州市中心醫(yī)院泌尿外科，江蘇 徐州 221009；2 徐州市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221009）

目的 克隆苦瓜Ⅰ型核糖體失活蛋白 MAP30 全長(zhǎng)基因并構(gòu)建其表達(dá)載體。方法 提取苦瓜的基因組 DNA，根據(jù) Genebank 中已公開發(fā)表的 MAP30 序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物。采用 PCR 技術(shù)，從苦瓜的基因組 DNA 中獲得 MAP30 全長(zhǎng)序列共 860bp，克隆入 pET-28a （+）載體中，進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。結(jié)果 克隆了 MAP30 全長(zhǎng)基因，經(jīng)測(cè)序證實(shí)與 Genbank 中收錄的 SEA 基因序列同源性達(dá) 100%。結(jié)論 本研究成功地克隆了 MAP30 全長(zhǎng)基因，為進(jìn)一步研究 MAP30 基因的靶向抗腫瘤研究奠定了基礎(chǔ)。

苦瓜Ⅰ型核糖體失活蛋白；載體構(gòu)建；序列分析

苦瓜（Momordica charantia，MC）為葫蘆科苦瓜屬植物，是一種藥食同源的植物，其根、莖、葉、花、果實(shí)、種子皆可入藥。具有清熱解毒、降低血糖、抗突變、抗HIV、抗腫瘤、抗生育、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等作用。苦瓜的活性成分種類繁多，包括苦瓜Ⅰ型核糖體失活蛋白（MAP30）、三萜類、生物堿類、甾類化合物、糖類、有機(jī)酸類及微量元素等。MAP30是苦瓜中相對(duì)分子質(zhì)量為30000的抗獲得性免疫缺陷綜合征病毒的蛋白質(zhì)，它屬于單鏈I型核糖體失活蛋白（ ribosome inhibiting protein，RIP）家族[1]，此類蛋白普遍存在于高等植物中，因可使真核細(xì)胞核糖體失活而得名，它具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌等多種生物活性。由于MAP30抗腫瘤活性強(qiáng)、毒性低，已成為近年抗癌藥物研究的熱點(diǎn)。本研究克隆苦瓜Ⅰ型核糖體失活蛋白（MAP30）全長(zhǎng)基因，為進(jìn)一步研究MAP30基因片段在抗腫瘤中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

幼嫩苦瓜1個(gè)，大腸埃希菌DH5a和質(zhì)粒pET-28a（+）為Sangon公司產(chǎn)品。T4DNA連接酶，Taq DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I均購(gòu)自Takara公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，其余試劑均為分析純。

1.2 苦瓜MAP30基因的擴(kuò)增

①引物設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI上的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物：Forward：5’-CGGGATCCATGGTGAAATGCTTACTAC-3’；Reverse：5’-CC GCTCGAGATTCACAACAGATTCC-3’，其中紅色部分分別為限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I酶切位點(diǎn)序列。②模板制備：刮取幼嫩苦瓜瓜皮，于液氮中研磨，按照植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行苦瓜基因組提取。③PCR擴(kuò)增MAP30全長(zhǎng)基因。④PCR產(chǎn)物回收：用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，并用Axygen公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的基因片段。

以上述所得基因組為模板，以pF和pR為引物，擴(kuò)增MAP30全長(zhǎng)基因，反應(yīng)體系如表1。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

1.3 將目的基因連接到載體pET-28a （+）

表1 PCR擴(kuò)增MAP30基因的反應(yīng)體系

將MAP30目的基因的PCR產(chǎn)物與pET-28a （+）載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，16℃反應(yīng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂氨芐抗性平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，篩選克隆，反應(yīng)體系如表2。

表2 PCR產(chǎn)物與pET-28a （+）的連接反應(yīng)

1.4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定和序列測(cè)定

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，反應(yīng)體系如表3。

表3 pET-28a （+）-MAP30酶切反應(yīng)體系

37 ℃作用2h后1%瓊脂糖凝膠電泳分析，各選擇酶切鑒定正確的兩個(gè)克隆送Invitrogen公司測(cè)序。

2 結(jié) 果

苦瓜MAP30基因的克隆：根據(jù)NCBI GenBank上公布的MAP30全基因序列，在MAP30基因閱讀框起始與末尾設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增目的基因。目的基因片斷長(zhǎng)度約為860bp，與理論值相符。

3 討 論

Ⅰ型核糖體失活蛋白（ribosome inhibiting protein，RIP）是一種強(qiáng)堿性單鏈蛋白質(zhì)，主要富集在苦瓜種子、根、莖及葉中，具有抗腫瘤和抗病毒等生物學(xué)活性。此類蛋白的主要功能是N-RNA糖苷酶活性及切斷DNA超螺旋活性，故核糖體失活蛋白可能具有類SOD活性。研究表明，MAP30對(duì)許多腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。Park等[7]發(fā)現(xiàn)MAP30對(duì)許多類型病毒感染的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞非常有效，而對(duì)未感染的人正常細(xì)胞，包括T2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞以及非腫瘤患者的血、腎臟、肝臟、神經(jīng)、精子細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和胚胎細(xì)胞等均無(wú)毒性。

MAP30 抗腫瘤作用的機(jī)制可能的途徑包括：①抑制核糖體活性。MAP30為RIP，具有N-糖苷酶活性，能使游離核糖體28S rRNA的A4324或G4323脫去一個(gè)A，核糖體失去活性，抑制真核生物蛋白質(zhì)合成，也能作用于DNA和RNA，使環(huán)狀DNA變?yōu)橥負(fù)?學(xué) 失 活 狀 態(tài)[8]； ② 誘 導(dǎo) 細(xì) 胞 凋 亡 。 熊 術(shù) 道 等[5]研 究 表 明 ， 苦 瓜 蛋白對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)具明顯抑制作用，其機(jī)制主要通過(guò)下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，從而下調(diào)Bcl-2/Bax 比值來(lái)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞凋亡通路順利進(jìn)行；Fan 等[9]在實(shí)驗(yàn)中明顯觀察到MAP30導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，Northern blots和Westernblots分析結(jié)果顯示，凋亡前期蛋白Bax 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平均隨之上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平則有所下調(diào)。首次證明了MAP30有誘導(dǎo)人大腸癌LoVo 細(xì)胞凋亡的重要作用。Sun等[10]利用基因芯片分析表明，MAP30通過(guò)上調(diào)與細(xì)胞凋亡直接相關(guān)的Bxa、Caspase-3和ARADD基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。熊術(shù)道等[11]研究表明苦瓜蛋白可致粘附分子CD54表達(dá)上調(diào)，使細(xì)胞粘附性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡；③下調(diào)腫瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)基因。Sun等[10]利用基因芯片發(fā)現(xiàn)MAP30下調(diào)一些在腫瘤細(xì)胞的增殖和膨大中起作用的基因而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。④抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性及表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲；⑤調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子的表達(dá)水平[11]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用基因重組技術(shù)，以聚合酶鏈反應(yīng)方法獲得了MAP30基因全長(zhǎng)片段 ，通過(guò)酶切、純化、連接等重組方法，構(gòu)建帶有目的基因片段的克隆載體pET-28a （+）-MAP30，為進(jìn)一步研究MAP30基因在真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白，并進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性奠定基礎(chǔ)。

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R394

：B

：1671-8194（2013）02-0057-02

中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目資助（LZ11134）；徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（XZZD1030）

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