王素梅

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理教研室，遼寧 錦州 121000;2.盤錦市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧 盤錦 124000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚，糖脂代謝紊亂、腎素血管緊張素系統(tǒng)的激活、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡等因素都參與其發(fā)生發(fā)展，其中氧化應(yīng)激在DN 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［1］，活性氧族(reactive oxygen species，ROS)增加及機(jī)體炎癥反應(yīng)在糖尿病繼發(fā)性病變中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用［2－3］。研究顯示［4］，糖尿病常伴有多種細(xì)胞因子水平的改變，單核/巨噬細(xì)胞的趨化積聚對(duì)最后的腎臟損傷有著重要影響，MCP－1 被認(rèn)為是引起其作用的重要調(diào)節(jié)因子，影響著巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和腎小球硬化。本研究通過(guò)觀察探討坎地沙坦對(duì)糖尿病腎臟氧化應(yīng)激及MCP－1 表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討坎地沙坦酯對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性SD 大鼠40 只，體重250～300 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma 公司)，MDA、SOD 試劑盒(北京建成生物工程研究所)，抗大鼠MCP－1 多克隆抗體(京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動(dòng)物模型對(duì)建立

健康SD 大鼠40 只，雄性200～250 g 左右(由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A)10 只，糖尿病模型組(B)10 只，坎地沙坦酯(C)低、高劑量組(D)各10 只。糖尿病組和坎地沙坦酯組均一次性給予鏈脲佐菌素(Sigma 公司)50 mg·kg－1(體重)左下腹腔注射，72 h 后尾靜脈取血測(cè)血糖，血糖≥16.7 mmol·L－1，尿糖陽(yáng)性者定為糖尿病大鼠模型。對(duì)照組給予等量檸檬酸緩沖液。坎地沙坦組按低、高劑量分別給予坎地沙坦酯5、10 mg/ (kg·d)，溶于0.9%氯化鈉溶液1.5 mL，灌胃1 次，連續(xù)12 周。

1.3 樣品采集及處理方法

成模飼養(yǎng)12 周后，用20%烏拉坦(5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，頸總動(dòng)脈取血2 mL，離心10 min (3000 r/min)，分離血清，－80 ℃保存，用于生化指標(biāo)測(cè)定。腎臟以冰生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干水分后稱重，計(jì)算腎臟質(zhì)量指數(shù)=腎重/體重，左腎凍存于－80 ℃冰箱中，用于Western印跡檢測(cè);右腎以10%中性甲醛溶液固定，PBS沖洗，石蠟包埋，制成4 μm 切片，用于光鏡觀察及免疫組化檢測(cè)。

1.4 血清中尿素測(cè)定

采用日立7180 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定UREA。

1.5 血清及腎組織MDA 含量、SOD 活性測(cè)定

丙二醛(MDA)用硫代巴比妥酸(TBA)法，超氧化物歧化酶(SOD)活性用黃嘌呤氧化酶法。SOD 測(cè)定原理:通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2－)，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。通過(guò)公式計(jì)算出被測(cè)樣品中SOD 活力。具體操作按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 免疫組化方法檢測(cè)MCP－1 蛋白表達(dá)

采用免疫組化ABC 染色法，切片厚4 μm，常規(guī)脫蠟水化，一抗為兔抗大鼠Bcl－2、P53 單克隆抗體(1 ∶50 稀釋)，二抗為生物素化羊抗兔lgG(1 ∶100 稀釋)，以PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。Bcl－2為細(xì)胞質(zhì)和核膜表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞為黃色或棕黃色，陰性對(duì)照用PBS 代替Ⅰ抗。

1.7 western 印跡檢測(cè)MCP－1 蛋白表達(dá)及半定量分析

取大鼠腎組織，立即放入預(yù)冷的裂解緩沖液中，4 ℃超聲粉碎，12000 × g 離心30 min，取上清，用Lowry 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。用10%～12%的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)分離蛋白質(zhì)，每個(gè)泳道蛋白上樣量為20 μg。一個(gè)泳道加SeeBlue Plus 2 預(yù)染蛋白標(biāo)記物，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，取出后將膜放入3 % BSA 阻斷緩沖液中，封閉60 min，再用TBS 洗膜3 次，每次10 min。將膜放入一抗中(抗體1 ∶500 稀釋)，4 ℃過(guò)夜。TTBS 沖洗后，將膜放入二抗(二抗均1 ∶500 稀釋)中，室溫孵育1～2 h，然后用TTBS 洗膜3 次，每次10 min。將膜在Super Signal West Pico 底物工作液中孵育5 min，進(jìn)行Ecl 化學(xué)發(fā)光。測(cè)定MCP－1。每個(gè)抗體測(cè)定時(shí)都進(jìn)行β－肌動(dòng)蛋白測(cè)定，以保證蛋白上樣量的一致性。利用Visionworks 6.3.3.圖像采集及分析軟件對(duì)蛋白帶進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用χ2表示，用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用one－way ANOVA 和LSD－t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況及血糖變化

病程12 周時(shí)，糖尿病組大鼠“三多一少”癥狀明顯，精神萎靡，體毛脫落?？驳厣程辊ジ鲃┝拷M大鼠一般情況優(yōu)于糖尿病組。

DM 組血糖一直在高水平波動(dòng)，與A 組比較明顯升高(P ＜0.01);坎地沙坦酯各劑量組血糖與糖尿病組相比降低不明顯(P ＞0.05)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 坎地沙坦酯對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響

2.2 坎地沙坦酯對(duì)糖尿病大鼠腎質(zhì)量指數(shù)影響

與A 組相比，DM 組大鼠腎質(zhì)量指數(shù)明顯升高(P ＜0.01);坎地沙坦酯各劑量組腎質(zhì)量指數(shù)與DM 組相比有不同程度的降低見(jiàn)表2。

表2 坎地沙坦酯對(duì)糖尿病大鼠體重及腎臟質(zhì)量指數(shù)的影響(，n=8)

2.3 坎地沙坦酯對(duì)糖尿病大鼠尿素水平的影響

與A 組相比，B 組大鼠尿素明顯升高(P ＜0.01);而不同濃度的坎地沙坦酯劑量組尿素明顯降低(P ＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 地沙坦酯對(duì)糖尿病大鼠血清尿素氮水平的影響(，n=10)

2.4 坎地沙坦酯對(duì)糖尿病大鼠MDA 含量及SOD活性的影響

結(jié)果顯示，與A 組相比，B 組MDA 含量顯著升高 (P ＜0.01)，SOD 活性顯著降低 (P ＜0.05);與B 組相比，C 組、D 組SOD 活性有不同程度的升高(P ＜0.05)，見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清及腎組織SOD 活性、MDA含量變化(，n=8)

2.5 坎地沙坦酯對(duì)糖尿病大鼠腎臟MCP－1 蛋白表達(dá)的影響及半定量分析(Western Blot)

與A 組相比，B 組中MCP－1 蛋白表達(dá)均明顯升高(P ＜0.01);而坎地沙坦酯各劑量組與B 組相比，MCP－1 蛋白表達(dá)明顯減少(P ＜0.05)，見(jiàn)表5、圖1。

表5 坎地沙坦酯對(duì)糖尿病大鼠腎臟MCP－1 蛋白表達(dá)的影響(χ2，n=3)

2.6 坎地沙坦酯對(duì)糖尿病大鼠腎臟MCP－1 蛋白表達(dá)的影響(免疫組化法)

MCP－1 在各組大鼠腎皮質(zhì)均有表達(dá)。A 組大鼠腎組織MCP－1 有較少表達(dá)，可見(jiàn)少量散在的棕黃色顆粒。B 組中MCP－1 蛋白表達(dá)明顯增加，可見(jiàn)較多的棕黃色顆粒，坎地沙坦酯用藥組MCP－1蛋白表達(dá)明顯減弱，見(jiàn)圖2。

3 討 論

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)系糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥，其機(jī)制尚未完全闡明，氧化應(yīng)激是其發(fā)生發(fā)展的共同機(jī)制［5］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，并應(yīng)用坎地沙坦酯干預(yù)治療。觀察坎地沙坦酯對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激及尿MCP－1 的水平、腎組織MCP－1 蛋白表達(dá)及腎臟結(jié)構(gòu)、功能的影響，探討坎地沙坦酯腎臟保護(hù)作用及可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中DM 組大鼠血清尿素水平升高，腎臟質(zhì)量指數(shù)增加;應(yīng)用坎地沙坦酯后，各劑量組血清尿素水平降低，腎臟質(zhì)量指數(shù)下降，提示坎地沙坦酯對(duì)糖尿病大鼠腎臟損傷具有保護(hù)作用。

在正常情況下，活性氧產(chǎn)生和活性氧的清除處于平衡狀態(tài)，當(dāng)活性氧產(chǎn)生能力超過(guò)清除能力時(shí)，蓄積過(guò)多的活性氧就會(huì)攻擊機(jī)體，產(chǎn)生氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激對(duì)糖尿病腎病的影響包括活性氧對(duì)腎小球血管通透性及血流動(dòng)力學(xué)的影響，對(duì)腎細(xì)胞的損傷以及對(duì)腎組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的影響等。本實(shí)驗(yàn)中DM 組大鼠腎組織及血清MDA 含量增加，SOD 活性下降，提示氧化應(yīng)激損傷參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

MCP－1 是趨化性細(xì)胞因子C－C 亞家族成員之一，由單核細(xì)胞及其他非白細(xì)胞所分泌［6］，其主要功能是趨化單核/巨噬細(xì)胞至炎癥部位［7］。正常腎組織中系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞等均可分泌微量的MCP－1，其表達(dá)依賴于細(xì)胞核因子κB 及轉(zhuǎn)錄因子AP－1 的協(xié)調(diào)作用［8］。近年研究認(rèn)為［9］，腎小球中由于單核細(xì)胞趨化蛋白l (MCP－l)合成和分泌增加，從而趨化和激活單核/巨噬細(xì)胞和部分T 淋巴細(xì)胞，吸引其向病變部位的聚集、浸潤(rùn)，經(jīng)一系列炎癥反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物、以及補(bǔ)體活化等，參與了DN 的發(fā)生、發(fā)展。糖尿病時(shí)腎臟固有細(xì)胞分泌MCP－1 增強(qiáng)，大量MCP－1 可促使單核/巨噬細(xì)胞在腎臟廣泛積聚，促進(jìn)腎臟表達(dá)多種生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞增生、活化，產(chǎn)生大量膠原和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生［10－11］。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病大鼠腎組織中MCP－1 表達(dá)水平升高，進(jìn)一步證實(shí)了糖尿病狀態(tài)下MCP－1 分泌增加。

坎地沙坦酯作為一種血管緊張素Ⅱ1 型受體拮抗劑，可在受體水平完全阻斷AngⅡ的作用，對(duì)腎臟有保護(hù)作用［12］。許多證據(jù)已經(jīng)證明，ARB 類能夠通過(guò)阻斷腎素－血管緊張素醛固酮系統(tǒng)減少糖尿病腎病尿蛋白排泄［13］。血管緊張素Ⅱ1 型受體拮抗劑坎地沙坦可延緩糖尿病腎臟損傷，但其作用機(jī)制目前仍不完全明確。本研究應(yīng)用坎地沙坦酯干預(yù)后，糖尿病大鼠腎臟病理變化較輕，腎功能明顯改善，提示坎地沙坦酯對(duì)延緩糖尿病腎病具有一定的保護(hù)作用。且坎地沙坦酯能減少M(fèi)DA 含量，升高SOD 活性，降低糖尿病大鼠腎臟MCP－1 蛋白表達(dá)，提示坎地沙坦酯對(duì)DN 的保護(hù)作用可能與抑制氧化應(yīng)激及下調(diào)MCP－1 的表達(dá)有關(guān)。

圖1 各組大鼠腎臟MCP－1 蛋白表達(dá)(western Blot 法)

圖2 各組大鼠腎臟MCP－1 蛋白表達(dá)(免疫組化法×400)

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