董新民,董泉聲,張曉瓊,朱漓

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不同施灸面積的灸法退熱作用與體溫調(diào)節(jié)中樞溫度敏感神經(jīng)元活動(dòng)的關(guān)系

董新民,董泉聲,張曉瓊,朱漓

(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院針灸經(jīng)絡(luò)研究所,成都 610031)

觀察灸法退熱的體溫中樞效應(yīng)與穴區(qū)施灸面積之間的關(guān)系。選用新西蘭兔30只,分為A組(靜脈注射內(nèi)毒素造模)、B組(注射內(nèi)毒素后行40℃灸,施灸圓面直徑為10 mm)、C組(注射內(nèi)毒素后行40℃灸,施灸圓面直徑為20 mm)、D組(注射內(nèi)毒素后行48℃灸,施灸圓面直徑為10 mm)、E組(注射內(nèi)毒素后行48℃灸,施灸圓面直徑為20 mm),每組6只。實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物肌肉松弛、行人工呼吸條件下進(jìn)行。穴位取至陽穴,以視前區(qū)-下丘腦前部熱敏神經(jīng)元放電為指標(biāo),觀察5組處理對(duì)熱敏神經(jīng)元放電的影響。B組與C組、D組與E組比較,中樞溫度敏感神經(jīng)元的放電變化有明顯差異,這種差異是由于施灸面積的改變而引起,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),具有顯著的正相關(guān)關(guān)系。穴位施灸面積的大小能夠影響療效。

灸法;熱證;施灸面積;多覺型感受器;熱敏神經(jīng)元

灸量,即施灸時(shí)灸火在皮膚上(著膚或不著膚)燃燒所產(chǎn)生的刺激強(qiáng)度,與療效緊密相關(guān)。影響灸量的4個(gè)因素為灸火、灸距、施灸時(shí)間和施灸頻度[1-2]。灸火的大小、灸距的長(zhǎng)短轉(zhuǎn)化為對(duì)皮膚感受器刺激的適宜指標(biāo)(即可影響皮膚感受器活動(dòng)的指標(biāo))是被灸穴區(qū)的皮膚溫度和面積,我們稱之為施灸溫度和施灸面積。施灸溫度與退熱效應(yīng)及其中樞機(jī)制的研究,筆者已作報(bào)道[3]。本實(shí)驗(yàn)觀察不同施灸面積的灸法退熱作用與體溫調(diào)節(jié)中樞溫度敏感神經(jīng)元活動(dòng)的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)選用由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)(許可證號(hào)SCXK-14)供應(yīng)的健康新西蘭兔,月齡為3～6個(gè)月,體重為2.6～4.4 kg。

1.2 開顱前的處理及開顱手術(shù)

實(shí)驗(yàn)前一天,手術(shù)野(顱頂、雙側(cè)顴弓、頸部)和施灸部位剪毛與脫毛(BaS劑)。實(shí)驗(yàn)日肌注慶大霉素4萬單位,在無菌和普魯卡因局麻條件下作顴弓鉆孔(固定頭顱用)和氣管插管手術(shù)。將兔轉(zhuǎn)移入屏蔽室,靜脈注射三碘季銨酚(12 mg/h)麻痹肌肉,行人工呼吸,通氣量按呼氣末CO2分壓調(diào)定(由美國(guó)Med Tech international Inc.BMI-331A型脈搏血?dú)?呼氣末CO2監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè))。用額部與顴弓頂針法固定頭顱。自耳緣靜脈滴注糖鹽水,補(bǔ)充體液與能量。藉空調(diào)機(jī)恒定室溫(25±1)℃。由自控加熱器(仿上海生理所復(fù)制)與保溫毯穩(wěn)定體溫(約38.5℃)。在無菌和局麻條件下自額至枕部切口,暴露顱骨,按Sawyer圖譜[4]要求,采用自制前后向與左右向水平儀確定顱骨水平位。

參考Sawyer圖譜,用牙鉆開顱3處。①改變腦組織溫度的U形灌流管孔,位于A4.4～P0.4、L0.5-1.7,垂直下插外徑0.9 mm的不銹鋼U形管。②測(cè)定POAH區(qū)腦內(nèi)溫度的溫度傳感器孔,位于A2.0、L3.8,孔徑1 mm,下插包埋傳感器的9號(hào)針頭。上列2個(gè)插入管周圍的縫隙敷以瓊脂,再用牙科水門汀固定。③微電極探測(cè)孔,位于A4～AP0,R0.5-4.5。開孔后在體視顯微鏡(瑞士Wild Heerbrugg Ltd M8型)下剪除硬腦膜,覆蓋以瓊脂。

1.3 鑒別溫度敏感神經(jīng)元與微電極尖端定位

由立體定位儀(西安西北光學(xué)儀器廠WDT-Ⅱ)定位,藉微電極推進(jìn)器推進(jìn)能長(zhǎng)時(shí)程記錄的鎢絲微電極[5],作細(xì)胞外記錄。電極尖端為0.5～1m,阻抗為0.5～1MW。自恒溫浴槽由蠕動(dòng)泵將冷(25℃)、熱(41℃)灌流液(水)依次輸經(jīng)U形管以改變腦組織溫度,觀察神經(jīng)元放電變化規(guī)律,鑒別溫度敏感神經(jīng)元。神經(jīng)元放電頻率隨腦溫之降、升而減少與增高者為熱敏神經(jīng)元(heat-sensitive neuron,HSN),反之者為冷敏神經(jīng)元(cold-sensitive neuron,CSN),如無明顯變化者則為溫度不敏感神經(jīng)元。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),用凝固法定點(diǎn)微電極尖端部位。取出全腦,用10%甲醛固定腦組織。置腦于厚片切片機(jī)內(nèi),擺正兔腦位置,以微電極孔為準(zhǔn)作0.5 mm厚切片。先在體視顯微鏡下檢查,取有標(biāo)定點(diǎn)痕跡腦片,置于掃描儀(美國(guó)HP公司ScanJet6300C型)掃描取樣。掃描精度為1200 dpi。

1.4 內(nèi)毒素發(fā)熱模型

內(nèi)毒素(Endotoxin,ET)是一種具有較強(qiáng)致熱作用的外源性致熱原,給家兔靜脈注射適量ET,即可在17 min左右出現(xiàn)耳溫降低[6],即散熱減少,提示體內(nèi)蓄熱開始,其后體現(xiàn)為體溫升高。筆者采用細(xì)菌ET工作標(biāo)準(zhǔn)品,由中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)。動(dòng)物于HSN放電穩(wěn)定后采集對(duì)照(基礎(chǔ))數(shù)據(jù),繼而每兔靜注內(nèi)毒素25 EU,分組處理并持續(xù)觀察記錄HSN放電2 h。

1.5 取穴、灸法、分組與施灸方案

取至陽穴,該穴位于T7-8棘突之間的凹陷處。穴區(qū)剪毛,留殘樁約1 mm,穴區(qū)用直徑10 mm或20 mm的圓孔形粘貼紙規(guī)范,施灸面積(S)=(直徑/2)2×p,S2/S1=4。

灸法采用聚光灸,光源為聚光燈,均勻光斑大小接近定形的圓形穴區(qū),聚光灸與計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī),穴區(qū)控溫精度為設(shè)定值±0.2℃。穴位施灸15 min為1個(gè)周期,周期內(nèi)先按設(shè)定值溫度連續(xù)灸10 min,其后停灸5 min;注射ET后即開始行灸,共施灸4個(gè)周期,完成施灸后繼續(xù)觀察記錄1 h。施灸方案圖見圖1。

注:A為靜脈注射內(nèi)毒素造模;B為注射內(nèi)毒素后行40℃灸,施灸圓面直徑為20 mm;C為注射內(nèi)毒素后行48℃灸,施灸圓面直徑為20 mm;x軸為時(shí)間(s);y軸為神經(jīng)元放電脈沖數(shù)/s

選用新西蘭兔30只,分為A組(靜脈注射內(nèi)毒素造模)、B組(注射內(nèi)毒素后行40℃灸,施灸圓面直徑為10 mm)、C組(注射內(nèi)毒素后行40℃灸,施灸圓面直徑為20 mm)、D組(注射內(nèi)毒素后行48℃灸,施灸圓面直徑為10 mm)、E組(注射內(nèi)毒素后行48℃灸,施灸圓面直徑為20 mm),每組6只,雌雄各半,共30例。經(jīng)鑒別為HSN的列入實(shí)驗(yàn)組,為CSN的僅觀察不列入。

1.6 信息采集

神經(jīng)元放電經(jīng)微電極放大器(上海生理所MIS-9403型)、前置放大器(上海華山醫(yī)療用品廠FJC-1型)、時(shí)間-幅度窗口鑒別器(上海生理所TAWD-94型)輸入二線示波器(汕頭超聲電子儀器廠SBR-1型),鑒別器與示波器協(xié)同選擇擬取神經(jīng)元的放電脈沖,放電脈沖和POAH區(qū)溫度信息輸入“生理實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)”(成都儀器廠RM6240C型),由該系統(tǒng)記錄,采樣頻率10 kHz。于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物HSN放電穩(wěn)定后開始采集,5 min前對(duì)照期后每兔靜脈注射內(nèi)毒素25 EU,隨之給予穴位灸法刺激(B組、C組、D組、E組)或不給予灸法刺激(A組),實(shí)驗(yàn)全程連續(xù)記錄HSN放電130 min以上,一次實(shí)驗(yàn)采集數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)量為700～800 MB。

1.7 數(shù)據(jù)處理

1.7.1 原始數(shù)據(jù)

來源于“生理實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)”采集的HSN放電脈沖,以每秒的脈沖個(gè)數(shù)作為放電脈沖頻率(Hz)。

1.7.2 頻率均數(shù)

為便于對(duì)HSN在2 h內(nèi)的放電頻率變化趨勢(shì)進(jìn)行描述和統(tǒng)計(jì),筆者運(yùn)用了“采樣”的概念,以某一時(shí)段的HSN放電頻率算術(shù)平均數(shù)(以下簡(jiǎn)稱“頻率均數(shù)”)代表這一時(shí)段觀察值的平均水平,采樣時(shí)段間隔(即采樣周期)相對(duì)于整個(gè)發(fā)熱周期[6]必須符合奈奎斯特采樣定理。另外,還需避免施灸時(shí)可能引入的電子干擾信號(hào),取樣時(shí)段定在停灸間期的5 min,稱作“5 min時(shí)段”,每次實(shí)驗(yàn)全程按時(shí)序共可取9個(gè)5 min時(shí)段,采樣周期為1/4 h。這9個(gè)時(shí)段是靜脈注射ET前的5 min時(shí)段作為前對(duì)照時(shí)段(﹣5～0 min時(shí)段),其后灸法刺激的4個(gè)施灸期后有4個(gè)停灸的5 min時(shí)段,完成施灸后仍以此規(guī)律,間隔10 min采樣1個(gè)5 min時(shí)段,連續(xù)可采樣4個(gè)5 min時(shí)段,采樣方式見圖1。每個(gè)HSN在5 min時(shí)段的放電頻率均數(shù)來源于60個(gè)/min×5 min=300個(gè)原始數(shù)據(jù),每組HSN在每個(gè)時(shí)段的原始數(shù)據(jù)是300×6=1800個(gè)。

1.7.3 定基比

9個(gè)5 min時(shí)段的放電頻率均數(shù)是一組按時(shí)間順序排列的動(dòng)態(tài)數(shù)列,用以觀察、比較HSN的放電在時(shí)序上的變化規(guī)律,而同一處理組內(nèi)每個(gè)HSN的同質(zhì)放電會(huì)有很大差別,為了消除這種內(nèi)部構(gòu)成差別,提高可比性,筆者引入了標(biāo)準(zhǔn)化的概念[7],以前對(duì)照5 min時(shí)段的放電頻率均數(shù)作為基期指標(biāo)值,計(jì)算出每個(gè)5 min時(shí)段放電頻率均數(shù)的定基比[8](以下簡(jiǎn)稱“定基比”),作為差異性分析的數(shù)據(jù)。為便于敘述,我們將前對(duì)照時(shí)段定義為“1時(shí)段”,其后各時(shí)段按序排列,分別定義為“2、3……9時(shí)段”。

1.7.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)量采用“定基比”,定基比是經(jīng)放電頻率﹣5 min時(shí)段放電頻率均數(shù)-標(biāo)準(zhǔn)化-定基比的轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)比率,雖然其可比性得到極大提高,但數(shù)據(jù)的分布已發(fā)生改變,故采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行對(duì)比分析。因?yàn)榻M間比較分析涉及差異分析和變量相關(guān)關(guān)系分析,具體的統(tǒng)計(jì)方法詳見相應(yīng)的結(jié)果章節(jié)。統(tǒng)計(jì)工具采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果

2.1 觀察單位的分布

以立體定位儀的定位數(shù)據(jù)定義觀察單位所在的部位,5組30個(gè)HSN的分布范圍介于A1.0～2.5、R1.4～1.6H1.500～-2.753,單位為mm。

2.2 A組、B組和D組熱敏神經(jīng)元全時(shí)段放電頻率均數(shù)定基比組間比較

筆者前期研究結(jié)果[3]已報(bào)道,B組熱敏神經(jīng)元全時(shí)段放電頻率均數(shù)定基比與A組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。D組熱敏神經(jīng)元全時(shí)段放電頻率均數(shù)定基比與A組和B組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。檢驗(yàn)結(jié)果見表1、圖2。

表1 5組5 min時(shí)段HSN放電頻率均數(shù)定基比比較

注:與A組比較1)＜0.01;與B組比較2)＜0.01;與C組比較3)＜0.01

注:↑表示A組靜注ET,B組、C組、D組、E組靜注ET并作施灸處理;↓表示B組、C組、D組、E組施灸結(jié)束

2.3 A組、C組和E組熱敏神經(jīng)元全時(shí)段放電頻率均數(shù)定基比組間比較

數(shù)據(jù)源見表1。每組6兔6個(gè)HSN在同一5 min時(shí)段的放電頻率按組采樣,求出定基比,作為本組在這個(gè)時(shí)段的樣本。基期指標(biāo)值是本組在前對(duì)照5 min時(shí)段的6個(gè)HSN放電頻率均數(shù)。如前所述,采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行對(duì)比分析,由于各組間的定基比無相互影響,需要比較的是兩組定基比總體分布的差異性,故采用兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)法,即檢驗(yàn)法[9]。

結(jié)果表明,C組熱敏神經(jīng)元全時(shí)段放電頻率均數(shù)定基比與A組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。E組熱敏神經(jīng)元全時(shí)段放電頻率均數(shù)定基比與A組和C組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。檢驗(yàn)結(jié)果見表1、圖2。檢驗(yàn)結(jié)果提示,注射ET后行48℃灸且施灸圓面直徑為20 mm拮抗ET抑制HSN放電的作用極其顯著,而行40℃灸且施灸圓面直徑為20 mm的這種作用甚微,這與在同溫施灸圓面直徑為10 mm的結(jié)果一致[3]。穴位施灸溫度不同,與不同類別皮膚感受器的被興奮與否有密切的關(guān)系,而48℃灸(無其他藥物介入)僅能興奮多覺型感受器(polymodal receptor,PR)[10-12],本文從體溫調(diào)節(jié)中樞的HSN水平表明灸法有效退熱的穴位物質(zhì)基礎(chǔ)主要是PR。

2.4 B組和C組熱敏神經(jīng)元分時(shí)段放電頻率均數(shù)定基比組間比較

由圖2可見,B組和C組在4～9時(shí)段之間的定基比有較大差異,這種差異是否與施灸面積相關(guān)?筆者取兩組在4～9時(shí)段的定基比與各組的施灸面積,進(jìn)行相關(guān)關(guān)系分析。數(shù)據(jù)源見表1。如前所述,采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法,由于筆者采樣的定基比是有序等間隔數(shù)據(jù),且不滿足正態(tài)分布,故采用非參數(shù)相關(guān)分析的等級(jí)相關(guān)系數(shù)[9]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。檢驗(yàn)結(jié)果表明,相關(guān)系數(shù)為0.029,＜0.05,即B組和C組在4～9時(shí)段放電頻率變化的差異與施灸面積的大小存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。

2.5 D組和E組熱敏神經(jīng)元分時(shí)段放電頻率均數(shù)定基比組間比較

由圖2可見,D組和E組在1～5時(shí)段之間的定基比有較大的差異,這種差異是否也與施灸面積相關(guān)?筆者取兩組在1～5時(shí)段的定基比與各組的施灸面積,進(jìn)行相關(guān)關(guān)系分析。數(shù)據(jù)源見表1。統(tǒng)計(jì)方法同上。檢驗(yàn)結(jié)果表明,相關(guān)系數(shù)為0.025,＜0.05,即D組和E組在1～5時(shí)段放電頻率變化的差異與施灸面積的大小存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

筆者已經(jīng)報(bào)道直徑為10 mm的施灸圓面在施灸溫度是40℃與48℃時(shí)對(duì)ET化兔體溫中樞熱敏神經(jīng)元活動(dòng)的影響[3],本文將同一穴區(qū)的施灸圓面直徑擴(kuò)大為20 mm,后者的面積是前者的4倍。C組與B組、E組與D組拮抗ET抑制體溫中樞熱敏神經(jīng)元放電的效應(yīng)比較,總體均未發(fā)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變,這說明對(duì)同一病癥,在保證一定施灸面積的基礎(chǔ)上,灸法要取得較好療效的關(guān)鍵是施灸溫度的控制[10],即PR的被興奮[11-12]。

B組和C組在4～9時(shí)段HSN放電頻率變化有一定的差異,即C組在4～9時(shí)段有部分拮抗ET抑制體溫中樞熱敏神經(jīng)元放電的效應(yīng),這種效應(yīng)與施灸面積有顯著的正相關(guān)關(guān)系,但C組效應(yīng)的總體變化與B組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。D組和E組在1～5時(shí)段HSN放電頻率變化有一定的差異,這種差異的發(fā)生同樣與施灸面積有顯著的正相關(guān)關(guān)系。由圖2可見,D組的定基比在1～4時(shí)段呈下滑趨勢(shì),這是ET作用使然,其后PR被興奮的作用才得以體現(xiàn),HSN放電頻率才逐漸恢復(fù)到正常水平,這是行48℃灸的作用體現(xiàn),而E組的定基比始終保持在正常水平,PR被興奮的作用始終體現(xiàn)為HSN放電頻率的穩(wěn)定,ET作用沒有得到表現(xiàn)的機(jī)會(huì)。綜上所述,擴(kuò)大施灸面積且灸溫較低的刺激效應(yīng)體現(xiàn)在時(shí)間上偏后且作用較差,而擴(kuò)大施灸面積且灸溫較高的刺激效應(yīng)在施灸的早期階段就可以突現(xiàn)?？傊?適當(dāng)提高施灸面積,可以部分提高或完善灸法的療效。

《小品方》:“灸不三分,是謂徒冤?！奔窗牡闹睆讲坏?分(按現(xiàn)行制式換算,3分=10 mm)大小,可謂白受灸灼之苦,可見古人在較早的時(shí)期就已經(jīng)意識(shí)到施灸面積的操控對(duì)療效的重要性。按Meeh算式[13]推算,體重60 kg人的體表面積約S人=1.89 m2,體重3 kg兔的體表面積約S兔=0.26 m2,S人/S兔≈7.3,人體要達(dá)到相當(dāng)于兔圓面直徑10 mm的施灸面積,需是圓面直徑10 mm的7倍(未經(jīng)科學(xué)驗(yàn)證,演算僅供參考)。顯然,增加相關(guān)施灸穴點(diǎn)是提高施灸面積的可行方法,如果不斷縮小施灸面積,或者減少施灸穴點(diǎn),前述面積與效應(yīng)的關(guān)系,可能會(huì)發(fā)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變,因?yàn)槭┚拿娣e的大小涉及到能被刺激的PR的多少。施灸溫度與施灸面積是灸法的技術(shù)核心,當(dāng)然,根據(jù)年齡、病情、體質(zhì)等諸因素,還需要調(diào)整有效的施灸時(shí)間,選配適宜的穴位,更需要不斷地研究和探索。

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To investigate a relationship between the reaction of thermoregulator centers to antipyretic moxibustion and its active area at the point.Thirty New Zealand rabbits were enrolled and allocated to groups A (intravenous injection of endotoxin for model making), B (intravenous injection of endotoxin followed by 40oC moxibustion with an active area of 10 mm in diameter), C (intravenous injection of endotoxin followed by 40oC moxibustion with an active area of 20 mm in diameter), D (intravenous injection of endotoxin followed by 48oC moxibustion with an active area of 10 mm in diameter) and E (intravenous injection of endotoxin followed by 48oC moxibustion with an active area of 20 mm in diameter). The experiment was performed under the relaxation of animal muscles and artificial respiration. Point Zhiyang was selected. Discharge of temperature-sensitive neurons in the preoptic-anterior hypothalamus was used as an index. The effect of treatment on discharge of temperature-sensitive neurons was observed in the five groups.Comparisons between groups B and C and between groups D and E showed significant differences in discharge of central temperature-sensitive neurons. The differences were caused by the change in the active area of moxibustion. Statistical analysis showed a significant positive correlation.The size of the active area of moxibustion at the point can influence the therapeutic effect.

Moxibustion; Heat syndrome; Active area of moxibustion; Polymodal receptor; Temperature-sensitive neurons

1005-0957(2013)07-0600-04

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2013.07.600

2012-12-25

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目(05JY029-043)

董新民(1951 - ),男,研究員