曾小平 單桂根 陳小銳

木棉葉總黃酮的提取工藝優(yōu)化研究

曾小平 單桂根 陳小銳

目的確定木棉葉總黃酮的最佳提取工藝條件。方法采用分光光度法，以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定木棉葉中的總黃酮含量，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)木棉葉總黃酮提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果確定木棉葉總黃酮的最佳提取工藝為取70目的藥材加入20倍量的80%乙醇回流1h，該提取工藝的總黃酮得率為25.172mg/g。結(jié)論本提取工藝具有簡(jiǎn)單、可靠、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可作為木棉葉總黃酮的最佳提取工藝。

木棉葉；總黃酮；工藝條件

木棉Gossampinus malabaria（DC.）Merr為木棉科木棉屬的植物，原產(chǎn)地為中國(guó)、越南、緬甸、印度等地。研究表明，木棉的主要化學(xué)成分為揮發(fā)性成分、三萜及黃酮類化合物，藥理活性主要有抗菌、抗炎、抗腫瘤及肝損傷保護(hù)等[1]。在木棉葉中分離出具有一定活性的黃酮類化合物，其中具有代表性的是槲皮素[2-3]。目前尚未見(jiàn)對(duì)木棉葉總黃酮提取工藝的報(bào)道，故本研究將在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)木棉葉總黃酮提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為今后開(kāi)發(fā)利用木棉葉總黃酮作鋪墊和參考。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)原料木棉葉：廣東翁源縣出品。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和主要試劑S22PC分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；BP211D電子分析天平（德國(guó)賽多利斯）；DFY-300搖擺式中藥粉碎機(jī)（中國(guó)浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；KQ-200VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；槲皮素對(duì)照品（100081-201106）；乙醇等均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品處理木棉樹(shù)葉陰干，稱取100g粉碎過(guò)篩網(wǎng)，置500ml錐形瓶中，加入200ml石油醚（60～90℃）攪拌搖勻后，靜置過(guò)夜，濾紙過(guò)濾，粉末50℃烘干，備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱取在105℃干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品25.05mg，置100ml容量瓶中，加入80%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度0.2505mg/ml的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 最大波長(zhǎng)的選擇精密吸取2.1中配制好的標(biāo)準(zhǔn)品5ml于50ml量瓶中，加入80%乙醇定容至刻度，在200～800nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在360nm處有最大吸收，所以選擇360nm為測(cè)量波長(zhǎng)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml置于50ml量瓶中，加入80%乙醇定容至刻度。在最大波長(zhǎng)360nm處，以槲皮素濃度（x）對(duì)吸光度（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，槲皮素溶液濃度在0.005～0.030mg/ml內(nèi)，濃度（x）與吸光度（y）之間呈良好的線性關(guān)系，如圖1。

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 樣品總黃酮含量測(cè)定精密量取樣品黃酮提取液10ml，置50ml容量瓶中，并加入PH=3.0的HCl溶液5ml與80%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置10min，在波長(zhǎng)360nm下測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中總黃酮含量?？傸S酮得率以1g原料中總黃酮的含量（mg）計(jì)算。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 不同倍量溶劑的選擇精密稱取2.1中處理的木棉葉干粉末3g，放入250ml的圓底燒瓶中，加入80%乙醇（5倍量、10倍量、15倍量、20倍量、25倍量、30倍量），在80℃水浴回流中提取2h，后用濾紙過(guò)濾，濾液待用。按2.5中方法測(cè)定總黃酮含量。由圖2可知，溶劑用量10～15倍時(shí)黃酮得率相對(duì)較高，當(dāng)15倍量時(shí)總黃酮得率最高。

圖2 提取溶劑倍量對(duì)總黃酮的影響

3.1.2 不同乙醇濃度的選擇按15倍量加入乙醇，濃度變量（50%、60%、70%、80%、90%），其余操作同3.1.1中方法。由圖3可見(jiàn)，乙醇濃度為70%～90%時(shí)對(duì)黃酮得率的影響明顯，當(dāng)80%乙醇時(shí)總黃酮得率最高。

圖3 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

3.1.3 不同回流時(shí)間的選擇按15倍量加入乙醇，回流時(shí)間變量為（1、2、3、4、5h），乙醇濃度為80%，其余操作同3.1.1中方法。由圖4可見(jiàn)，回流時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響不明顯，但當(dāng)回流時(shí)間為2h時(shí)總黃酮得率最高。

圖4 回流時(shí)間對(duì)提取效果的影響

3.1.4 不同粉碎粒度的選擇藥材粉碎時(shí)采用不同型號(hào)的篩網(wǎng)（50、60、70、80、100目），過(guò)篩后分別按15倍量加入濃度為80%乙醇，回流時(shí)間為2h，其余操作同3.1.1中方法。由圖5可見(jiàn)，不同藥材粉碎粒度對(duì)黃酮得率的影響明顯，當(dāng)粉碎粒度為70目時(shí)總黃酮得率最高。

圖5 不同粉碎粒度對(duì)提取效果的影響

3.2 正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)選擇各因素主要影響水平，回流溫度（A）、回流時(shí)間（B）、提取溶劑倍量（C）和乙醇濃度（D）進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)（各因素水平及結(jié)果見(jiàn)表1、2）。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平

表2 木棉葉總黃酮提取工藝優(yōu)化L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 木棉葉總黃酮提取工藝優(yōu)化方差分析結(jié)果

從表2結(jié)果可知，各因素影響的主次順序?yàn)橐掖紳舛龋净亓鳒囟龋炯尤胍掖急读浚净亓鲿r(shí)間。表3方差分析結(jié)果顯示，最佳提取工藝為A2B3C3D2，即取70目的藥材加入20倍量的80%乙醇回流5h。

3.3 工藝驗(yàn)證提取時(shí)間越長(zhǎng)，黃酮類物質(zhì)浸出提取越完全，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)雜質(zhì)浸出同時(shí)也增多，且黃酮長(zhǎng)期處于高溫溶液中易被氧化，回流時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響并不明顯，所以進(jìn)行工藝驗(yàn)證時(shí)選擇回流時(shí)間分別為1h和5h，即按A2B3C3D2和A2B1C3D2兩種工藝條件提取黃酮，平行測(cè)定3份進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，兩種工藝條件總黃酮得率平均分別為25.176mg/g、25.172mg/g。本著節(jié)約成本的原則，確定木棉葉總黃酮的最佳工藝為A2B1C3D2，即加入20倍量的80%乙醇在70℃水浴回流1h。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素考查和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)合工藝驗(yàn)證確定了木棉葉總黃酮的最佳提取工藝，取70目的藥材加入20倍量的80%乙醇回流1h。本提取工藝具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。在單因素實(shí)驗(yàn)中，可得出提取時(shí)間對(duì)總黃酮的提取率影響不明顯，從考慮到節(jié)約成本和工藝簡(jiǎn)單化的情況下進(jìn)行工藝驗(yàn)證，確定了最佳的提取時(shí)間為1h。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道[4-5]，木棉葉的總黃酮主要以黃酮苷的形式存在，所以在總黃酮的提取過(guò)程中，加入適量的酸水可使其水解。植物中所含的色素往往對(duì)吸收峰有干擾，所以有必要去除一部分色素，采用石油醚萃取法可去除木棉葉中的絕大部分色素[6]，對(duì)回流提取法具有實(shí)用性、安全性及簡(jiǎn)單性，在實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中更能體現(xiàn)其設(shè)備要求低、簡(jiǎn)便、成本低廉的特點(diǎn)。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典·上冊(cè)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社,1975：364.

[2] 齊一萍,郭舜民.木棉的化學(xué)成分與藥理作用研究[J].福建醫(yī)藥雜志,2002,24(3)：119.

[3] 王國(guó)凱,林彬彬,劉欣欣,等.木棉葉酚性成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2012,24(03)：336-338,341.

[4] 劉欣欣,王國(guó)凱,秦民堅(jiān).紫外分光光度法測(cè)定木棉葉中總黃酮的含量[J].中國(guó)野生植物資源,2011,30(06)：70-72.

[5] 周麗.葛根異黃酮的提取、純化及水解工藝的研究[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[6] 崔旭海.銀杏葉黃酮類化合物提取分離技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品工程,2008(4)：7-11.

Study on Optimum Process for Extraction of Total flavonoids from Gossampinus Malabaria Leaf

Zeng Xiaoping Shan Guigen Chen Xiaorui

ObjectiveTo determine the optimum extraction condition of total flavonoids from gossampinus malabaria leaf.MethodsIn this study,one-factor and orthogonal array design methods were used to optimize of total flavonoids from gossampinus malabaria leaf. The determination of total flavonoids was spectrometrically carried out using quercetin as the reference standard.ResultsThe optimal conditions for extracting total flavonoids from gossampinus malabaria leaf were 20 times the amount of ethanol, 80% ethanol as the extraction solvent, extraction time 1h, and 70 mesh crushed.The total flavonoids with the extraction process was 25.172mg/g.ConclusionThe extraction method is simple, rliable, and accurate, which can be used as the optimum extraction conditions of total flavonoids from gossampinus malabaria leaf.

Gossampinus malabaria leaf; Total flavonoids; Extraction condition

R284.2

A

1673-5846(2013)06-0033-03

清遠(yuǎn)市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東清遠(yuǎn) 511517